通过与MBP融合提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达

目的 探讨提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达的途径。方法 通过融合大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(mbp)基因到抗人纤维蛋白单链抗体(seFvⅡn)和抗结肠癌相关抗原单链抗体(ScFvSCll)的5′端，或者同时融合人抗体κ轻链恒定区(HuCκ)基因到单链抗体的3′端，构建成表达载体，在大肠杆菌中表达，观察融合蛋白的可溶性表达水平。结果 与MBP融合表达可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达，表达量占全菌蛋白的20％左右；同时融合表达HuCκ，融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量占全菌蛋白的30％左右。结论 与MBP及HuCκ融合表达可以明显提高含单链抗体的融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量.     

尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达(Ⅰ)

借鉴基因表达调控理论的研究结果和作者多年来对高效表达的研究经验,自行设计和构建了一个适合在哺乳动物细胞中高效表达外源基因的新型载体。将插入尿激酶原(pro—UK)cDNA的这一表达载体用磷酸钙共沉淀法转染CHO—dhfr~-细胞,经一系列筛选、MTX加压扩增、亚克隆和锌离子诱导,获得了高效表达尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的细胞株,表达水平达800～1500IU/(10~6细胞·d)。     

兔珠蛋白mRNA的简易提取方法

建立了一种提取兔珠蛋白mRNA的简易方法,省去了提取核糖体的步骤,提取的mRNA制品在酸性脲素琼脂糖凝胶电泳上显示9S带(珠蛋白mRNA),其体外转译产物中含珠蛋白。     

嵌合KGD序列的尿激酶原突变体的构建及表达

在尿激酶原cDNA分子对应于Kringle结构域的突环区域，插入编码特异四肽Lys-Gly-Asp-Trp(KGDW)分子的DNA片段，形成嵌入KGDW序列的尿激酶原突变体全长基因，并将其克隆至昆虫细胞杆状病毒表达载体，转染昆虫细胞SF9，表达嵌合突变基因，获得高效表达，对表达产物进行分离纯化获得纯品蛋白，纤维蛋白平板法检测表明嵌合突变体蛋白质具有明显的纤溶酶原激活剂活性，血小板聚集抑制实验表明突变体蛋白质具有明显的血小板聚集板制活性，该项研究为研制新型溶栓药物打下了基础，有望发展成为新型溶栓制剂。     

鼠单克隆抗体人源化

鼠源性单克隆抗体应用于临床由于ＨＡＭＡ反应的存在而受到阻碍。以ＣＤＲ移植为核心，以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服ＨＡＭＡ反应的主要手段。本文结合单克隆抗体人源化的最新进展对该领域的工作作一综述     

应用抑制消减杂交技术筛选动脉粥样硬化相关基因

目的　筛选动脉粥样硬化 (AS)相关基因。方法通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建的传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库 ,用聚合酶链反应方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆 ,将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析。建立兔AS模型 ,采用RNA点杂交技术鉴定部分筛选到的cDNA序列的AS相关性。结果　从消减文库中随机挑取的 75 0个白色克隆中筛选出 88个阳性克隆 ,DNA测序获得 6 1个cDNA序列 ,其中 2 6个为已知牛基因序列 ,19个与已知人基因具有高度同源性 ,其他 16个是未知基因片段。通过基因同源性分析 ,选择部分cDNA序列进行组织表达差异及其与AS病变的关系分析 ,结果表明 ,转录调节因子DEAD box ,Ⅻa因子抑制蛋白 ,淋巴调适蛋白和转位复合蛋白 β基因为AS相关基因。结论　这 4种基因为本文首次报道的AS相关基因。     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序鲁设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列，然后在化学合成１４条人源化单链抗体基因片段的基础上，利用二次ＰＣＲ方法构建完整的人源化单链抗体基因，并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上，利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因，并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的ＩＰＴＧ诱导表达。结果：构建     

全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库。方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库。结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因。经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础。