二硫键稳定的抗肝癌单链抗体-PE38融合基因的构建、表达与功能检测

目的：制备高特异性有杀伤活性的新型抗肝癌免疫毒素。方法：应用适当的酶切位点，将二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(dsFv)基因及PE38基因克隆入原核表达载体pTIG中。诱导表达上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化，用MTT比色法检测纯化表达产物的细胞毒活性。结果：目的融合蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达，表达产物的Mr为66000，表达量占菌体总可溶性蛋白量的21％。细胞毒实验表明，抗肝癌免疫毒素对肝癌细胞具有杀伤作用，而对正常肝细胞无损伤。结论：抗肝癌dsFv与PE38融合基因的成功构建及表达，为其作为抗肝癌药物的进一步研究打下了基础。     

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合，免疫毒索在大肠杆菌中的可溶性表达，为下游的活性检测等工作打下基础．方法：设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体)，并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等，优化表达条件；通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性．结果：抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达，表达量占菌体总可溶蛋白量的21％：ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性．结论：dsFv-PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达为其他融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供了思路．     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外成熟

目的 提高人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的亲和力和特异性，方法 以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体为基础，通过合成部分随机化的突变引物和PCR等方法构建HCDR3和LCDR3的混合突库，然后利用噬菌体表面呈现技术对抗体库进行筛选，并利用本实验室建立的单链抗体－碱性磷酸酶系统进行单克隆的鉴定。结果 得到4株亲和力和特异性有明显改善的人源化抗体。结论 构建CDR3突变库是抗体体外成熟的一个有效方法，该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定了基础。     

电击法转染COS-7细胞条件初探

电击法转染是近几年发展的1种新的细胞转染方法,它比经典的磷酸钙共沉淀法简便,快速,对质粒DNA 的纯度要求不高,常常能获得高的转染效率,但转染条件因细胞种类和电击仪而异。COS-7细胞是一个很好的暂时性表达系统,可进行多种基因的暂时性表达研究,尤其有利于基因改构时进行表达型筛选突变体;因而有必要建立适合 COS-7细胞的电击转染条件。本实验以尿激酶原(pro-UK)cDNA 为模型探索     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人论著TNFα融合基因在CHO(dhf)细胞中的表达

目的 :提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子 (hScFv2 5 hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体 突变体人TNFα融合基因 (ds ScFv hTNFα) ,并在CHO细胞中表达。方法 :常规构建ds ScFv hTNFα融合基因 ,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1) ,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO dhfr ) ,甲氨蝶呤 (MTX)高压筛选高表达细胞株 ,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果 :目的基因在CHO(dhfr )中获得了表达 ,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性 ,且稳定性得到大幅度提高 ,达到 4℃放置 4个月活性无明显下降。结论 :抗肝癌人源化ds ScFv hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

含有E tag的抗结肠癌相关抗原单链抗体的研制

在已构建的抗结肠癌相关抗原单链抗体基因的基础上,为方便其活性测定,设计了含有E tag的引物进行PCR扩增,以scFv-E tag融合基因的形式构建在质粒pET-22b(+)中,并在大肠杆菌中进行了表达。对表达产物的主要成分包涵体进行了变性、复性,ELISA及免疫组化SABC法对该单链抗体进行活性测定,结果表明它具有与原代单克隆抗体相似的抗原结合活性及组织特异性。     

利用同源重组建立CHO高表达细胞株

目的:利用同源重组的方法,克服基因组位置效应,建立CHO高表达细胞株.方法:通过弱化筛选基因,构建了一系列弱化筛选基因的载体,大规模筛选CHO基因组,寻找转录活跃区,并在此基础上构建同源重组载体系统,包括标记载体pExplorer和打靶载体pTarget.结果:利用带有弱化筛选基因的标记载体pExplorer寻找到了基础转录水平较高,并且适于加压的细胞克隆,报告基因UK的表达量在加压后稳定在10 μg·ml-1·24 h-1·10-6细胞.然后通过载体pTarget实现了在CHO细胞中的同源重组.结论:通过同源重组的方法,有效地克服了基因组位置效应,为建立哺乳动物高表达细胞株提供了一个新的更加有效的途径.