阿尔茨海默病多肽表位疫苗免疫原性研究

目的以淀粉样蛋白Aβ作为免疫靶标,优化阿尔茨海默病多肽B细胞表位疫苗。方法化学合成人Aβ1-42多肽、含B细胞表位的Aβ1-15多肽、含两个B细胞表位及一个辅助T细胞表位PADRE的多肽Aβ（1-15）2-PADRE及含13个氨基酸的PADRE。以上4种多肽免疫普通BALB/c小鼠,ELISA试验比较免疫后的小鼠血清抗体水平和亚型,点杂交分析其与不同状态Aβ的结合免疫特性。结果 Aβ（1-15）2-PADRE组免疫后诱导产生了良好的免疫效果,100μg组4次免疫后其抗体滴度可以达到1∶3500;抗体亚型分析后得知,其主要产生IgG1型抗体,免疫反应完全偏向于Th2型,其免疫血清可与不同状态Aβ的结合免疫特性不同。结论辅助T细胞表位PADRE增强了B细胞表位Aβ1-15的免疫效果,并且其免疫血清抗体与Aβ寡聚体结合效果更好。     

抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因。方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整κ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约３６０ｂｐ的片段；用轻链引物扩增获得约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列。结论：克隆的重链可变区基因长度为３６０ｂｐ，属于小鼠重链可变区Ｉ（Ｂ）亚族；κ轻链长度为６４２ｂｐ，其中可变区为３２１ｂｐ，属于小鼠κ轻链Ⅴ亚族。     

单链抗体在基因治疗方面的应用

单链抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）即众所周知的单链可变区片段（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉ－ａｂｌｅ ｆｒａｇｍ ｅｎｔｓ，ｏｒ ｓＦｖ）是将抗体重链可变区和轻链可变区以一个弹性连接肽连接成为一个单个的多肽，它们能较好地保持原代抗体的亲合性和特异性，是一种新的基因治疗的手段。本文对使用单链抗体治疗癌症以及控制传染病的一些新的研究进展作一综述，并对这一技术的进一步应用进行了讨论。     

人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建g3pN1 hCD2 0跨膜及胞外区基因表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法 :利用反转录PCR和PCR方法 ,分别从Daudi细胞和M13K0 7噬菌体中扩增hCD2 0基因和编码g3pN1蛋白N1端的基因 ,并重组到pTIG Trx表达载体中 ,在大肠杆菌中融合表达。结果 :表达产物可被抗CD2 0分子的单克隆抗体 (mAb)识别。结论 :成功地表达并鉴定了目的蛋白。     

多菌落分组PCR法从高背景中筛选重组子

多菌落分组ＰＣＲ法从高背景中筛选重组子王翔俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１在基因工程操作中，重组子的筛选、鉴定是必不可少的步骤，一般来说，这属于常规技术，不会有太大难度，但在很多情况下，人们会被很低的重组效率所困扰，如平端连接、部分...     

介导乙酰胆碱诱发内皮依赖性血管舒张反应受体的特性

目的　针对血管内皮细胞上是否存在M受体的疑点 ,从基因水平和信号转导机理上探讨介导乙酰胆碱 (ACh)诱发内皮依赖性血管舒张反应受体的特性。方法　以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞为实验材料 ,比较两种内皮细胞M1～M5受体mRNA的分布状况、ACh诱发细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)、环腺苷酸 (cAMP)含量变化。①设计高选择性、特异性寡核苷酸探针 ,采用点杂交方法对内皮细胞M1～M5受体mRNA进行分析 ,并通过反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、DNA序列测定及同源性分析确证点杂交的实验结果 ;②以Fluo 3和Fura 2为荧光探针 ,用共聚焦和荧光光度仪测定内皮细胞 [Ca2 + ]i 变化 ;③内皮细胞cAMP含量采用12 5I放射免疫分析方法测定。结果　在新鲜分离的牛主动脉内皮细胞存在M1～M4 受体mRNA ,内皮细胞经传代培养后仅检测到M4 受体mRNA ;1和 10μmol·L- 1ACh能够引起原代培养内皮细胞 [Ca2 + ]i增加 ,最大增加量为 12和 19nmol·L- 1;ACh激活原代培养内皮细胞的钙离子信号 ,表现为单次或连续2次的钙振荡 ,具有异时性和快速耐受的特点 ;此外 ,随ACh浓度增加 ,原代培养内皮细胞cAMP含量均呈微弱增加趋势 ;ACh不引起传代培养内皮细胞[Ca2 + ]i 浓度的改变 ,但能浓度依赖地降低cAMP含量。结论　新鲜分?     

外源蛋白在大肠杆菌中的折叠

大肠杆菌是表达外源基因最常用的宿主之一。它结构简单 ,遗传背景清楚 ,基因表达调控机制相对明确。随着对分子伴侣和折叠酶研究的深入 ,蛋白在大肠杆菌内的折叠机制逐渐为人们所认识。外源蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达问题也逐步得到解决     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

人CD20胞外区与噬菌体pⅢ融合基因在E．coil中的可溶性表达

目的：克隆人CD20胞外区基因(cdw)和丝状噬茵体(M13KD7)G3蛋白N端结构域(pⅢN1)基因，并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法：利用逆转录PCR和PCR方法分别克隆CD20胞外区基因和pⅢN1基因，然后将二者融合克隆入pTIG-Trx表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达。结果：可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的约25％，表达产物可被抗CD20分子的单克隆抗体识别。结论：成功地表达并鉴定了人CD20胞外区蛋白，为利用噬菌体抗体库进行抗CD20抗体的筛选奠定了基础。