BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及脑中分布

目的 在大肠杆菌中表达并纯化BDNF-TAT融合蛋白,研究其靶向性及在脑中的分布.方法 重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT转染至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导其表达后用SP-Sepharose阳离子交换柱纯化,纯化后蛋白用0.4 mol/L精氨酸倍比稀释法复性.KM种小鼠采用随机数字表法分为给药组[尾静脉注射复性后BDNF-TAT融合蛋白4 μg(适量生理盐水溶解)]、阴性对照组(尾静脉注射等体积生理盐水)和空白对照组(不进行任何处理),每组各3只.3 h后提取小鼠脑组织全蛋白,Western blotting检测脑组织中BDNF-TAT表达,SABC免疫组化染色观察BDNF-TAT在脑组织中的分布.结果 获得纯度约90%活性的BDNF-TAT融合蛋白.给药组BDNF-TAT蛋白的相对表达最为1.897±0.286,阴性对照组BDNF-TAT蛋白的相对表达量为0.615±0.234,空白对照组BDNF-TAT蛋白的相对表达量为0.335±0.154,比较差异有统计学意义(F=39.019,P=0.0000).免疫组化染色结果显示给药组BDNF-TAT主要分布于小鼠脑组织海马CA1、CA3和DG区,而阴性对照组和空白对照组巾没有明显阳性染色.结论 BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达,并能通过外周给药靶向至小鼠脑组织.

Abstract：

Objective To explore the expression and purification of BDNF-TAT fusion protein in E.coli, and study its brain-targeting and distribution in brain. Methods Plasmid PET-30(a) -BDNF-TAT was transfected into the E.coli BL21 (DE3)pLysS;the expression of PET-30(a)-BDNF-TAT was induced by isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside (IPTG);this BDNF-TAT fusion protein was purified by SP-Sepharose cation exchange column and then renatured by 0.4 mol/L arginine. According to the random number table method, KM mice were divided into 3 groups: BDNF-TAT treatment group (giving 4 μg BDNF-TAT through intravenous injection, n=3), negative control group (giving same volume of saline through intravenous injection, n=3) and blank control group (without giving any treatment, n=3). The whole brain protein was collected 3 h after the injection;Western blotting was used to identify the expression of BDNF-TAT fusion protein;the distributions of BDNF-TAT in the brain tissues were examined by SABC immunohistochemistry. Results BDNF-TAT fusion protein was purified with the purity about 90%. The relative expression of BDNF-TAT fusion protein was 1.897±0.286 in the BDNF-TAT treatment group, 0.615±0.234 in the negative control group, 0.335±0.154 in the blank control group;significant differences between each 2 groups were noted (F=39.019, P=0.000).Western blotting indicated that the content of BDNF-TAT in the mice brain in BDNF-TAT treatment group was obviously higher than that in the negative control group and blank control group (P<0.05);BDNF-TAT fusion protein were widely distributed in CA1,CA3 and DG areas of the hippocampus of brain tissues in the BDNF-TAT treatment group, while no obvious positive staining was noted in the negative control group and blank control group. Conclusion BDNF-TAT fusion protein abundantly expresses in E.coli in the form of inclusion bodies, and can target the brain tissue via a systemic route.     

HPLC法测定癣可净软膏的含量

用反相高效液相色谱法测定癣可净软膏的含量。以非那西丁为内标，甲醇－水为流动相，紫外检测波长为２８５ｍｍ。本法开始３．５ｍｉｎ内以６０％甲醇－水为流动相，３．５～１３．０ｍｉｎ内以１００％甲醇为流动相。平均回收率为９８．９％，ＲＳＤ＝０．５５％；日内精密度ＲＳＤ为１．３２％，日间精密度为１．８２％。     

莲子心超临界C02萃取物化学成分分析

目的:对莲子心超临界CO2萃取物进行化学成分分析.方法:采用超临界CO2萃取技术从莲子心中提取亲脂性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)计算机连用技术分离鉴定其中的化学组成,计算其相对含量.结果:萃取物得率为2.5%,萃取物主要由前荷叶碱等14种成分组成.结论:该法安全无毒,结果有效.     

前荷叶碱对血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的观察前荷叶碱对血管紧张素Ⅱ(A ngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC s)凋亡的影响,探讨其对HUVEC s的保护作用机制。方法体外培养HUVEC s细胞系ECV 304,以10μm o l/L卡托普利或10、1、0.1、0.01μm o l/L前荷叶碱作用于HUVEC s,30 m in后再加入A ngⅡ1μm o l/L,光镜下观察细胞形态,M TT法观察前荷叶碱对HUVECs活性的影响,比色法测定NO、总一氧化氮合酶(tNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果与对照组比较,Ang能明显诱导HUVECs的凋亡(P<0.01),10μmol/L卡托普利及0.01~10μmol/L前荷叶碱可明显改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),能增加HUVECs释放NO及生成tNOS(P<0.05),但对iNOS影响不大,使Ang诱导的HUVECs凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。结论前荷叶碱通过增加NO生成而抑制Ang诱导的HUVECs凋亡,从而发挥可能的内皮保护功能。     

脑源性神经营养因子融合蛋白对大鼠局灶性脑缺血治疗作用的初步研究

目的 研究脑源性神经营养因子融合蛋白(BDNF-PTD)在大鼠脑缺血模型中对大脑神经元的保护作用.方法 SD大鼠采用随机数字表法分为给药模型组、空白模型组、阴性对照组、正常组,每组5只.前3组大鼠通过线栓法制作脑中动脉栓塞模型;正常组大鼠正常喂养.不做任何处理.栓塞1 h后给药模型组腹腔注射50 μg(50 μg/mL)BDNF-PTD,阴性对照组注射1 mL生理盐水,空白模型组不做处理.采用Bederson评分评价各组大鼠神经功能缺损情况.24h后将各组大鼠断头取脑,大脑切片TTC染色,观察各组大鼠脑梗死面积.结果 给药模型组大鼠神经功能缺损不明显,Bederson评分明显低于空白模型组及阴性对照组(P<0.05).TTC染色结果提示给药模型组大鼠脑梗死区域面积较空白模型组、阴性对照组明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05).结论 BDNF-PTD能通过血脑屏障并且发挥其生物学效应.起到保护脑缺血后神经元作用.     

靶向VEGFR2基因的siRNA分子血清稳定性及其基因沉默效应

目的 设计并合成抗小鼠VEGFR2基因的siRNA分子(siVEGFR2),研究其血清稳定性和基因沉默效应,以便进一步研究经组织靶向性结构修饰后该siRNA分子的特性.方法 设计并合成抗小鼠VEGFR2基因的siRNA分子,在37℃条件下与新鲜血清共孵育24h,不同时间点后取样电泳观察其完整性;用脂质体介导转染体外培养的MS1细胞,通过半定量RT-PCR分析基因沉默效果.结果 随着孵育时间延长,未经修饰的siVEGFR2分子在血清中逐渐降解;经sivEGFR2转染的MS1细胞中,VEGFR2mRNA的表达水平明显下降,与空白转染组和对照siRNA转染组相比有显著差异(P<0.001),而空白转染组和对照siRNA转染组间比较无显著性差异(p=0.157).结论 裸siVEGFR2分子在血清中容易降解,siVEGFR2能特异性沉默靶基因的表达,为下一步体内应用siVEGFR2分子时稳定性修饰的必要性提供了理论依据.     

氧化低密度脂蛋白对大鼠心肌成纤维细胞胶原的影响

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)对大鼠心肌成纤维细胞胶原合成的影响.方法 体外培养乳鼠心肌成纤维细胞,加入ox-LDL(10、20、50、100μg/ml)干预24 h,3H-胸腺嘧啶核苷掺人法观察细胞DNA合成,3H-脯氨酸掺入法观察胶原的合成,酶谱法测定基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性,Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9的mRNA表达.结果 和对照组比较,ox-LDL作用于心肌成纤维细胞24 h后,呈浓度依赖性促进细胞DNA合成,同时抑制细胞胶原合成.ox-LDL显著增加MMP-2和MMP-9活性,但各组间作用无明显区别;同时MMP-2和MMP-9蛋白表达也显著性增加,以100μg/ml组作用最强.50μg/ml ox-LDL能显著增加MMP-2和MMP-9的mRNA表达,100μg/ml组作用更强.结论 ox-LDL作用于心肌成纤维细胞能减少胶原的合成并增加胶原的降解,提示其在心肌重构过程巾起一定的作用.     

钩藤对金银花水提工艺中绿原酸保留率的影响研究

目的 考察钩藤对金银花水提工艺中绿原酸保留率的影响.方法 采用HPLC测定金银花药材供试品、钩藤药材供试品、热毒清复方钩藤缺样供试品、金银花、钩藤药材合并提取供试品中绿原酸的含量.结果 金银花100℃提取的保留率为31.11％(提取时间过短,绿原酸保留率低),与钩藤合提时保留率为16.52％;金银花80℃温浸的保留率为63.98％,与钩藤合提时保留率为22.70％.结论 钩藤与金银花合并提取时,钩藤可导致绿原酸保留率下降.     

siRNAs对原代人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的 研究siRNA单独或多重沉默原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）及血管内皮细胞生长因子受体1/2/3（VEGFR1/2/3）表达对其血管生成的影响。方法 HUVECs分为空白对照组,阴性对照组与实验组。空白对照组不给予转染,阴性对照组转染100 nmol·L^-1 siNC,实验组分为4组并分别转染100 nmol·L^-1 siVEGFA及siVEGFR1/2/3。以反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测siRNAs的沉默效率。HUVECs分为空白对照组,阴性对照组,沉默单靶点组和多靶点组,空白对照组不给予转染,阴性对照组转染100 nmol·L^-1 siNC,沉默单靶点组分为4组并分别转染100 nmol·L^-1 siVEGFA及siVEGFR1/2/3,沉默多靶点组分为4组并分别转染100 nmol·L^-1 siVEGFA+siVEGFR1、siVEGFA+siVEGFR2、siVEGFA+siVEGFR3及siVEGFR1+si...