脑皮层创伤灶注射法移植神经干细胞实验研究

目的 观察食蟹猴自体骨髓源神经干细胞移植到大脑皮层创伤灶内的存活、生长情况.方法 取骨髓分离、纯化骨髓基质细胞,培养诱导成神经干细胞,nestin染色表达阳性后再加入细胞标记物BrdU进行共培养7d待移植用.移植前将BrdU标记的神经干细胞收集、离心,制成干细胞悬液,要求活细胞＞80%.食蟹猴在采用Allen's打击法制作皮层创伤灶后,分即时移植(术后即在创伤灶注入,n=3)和延迟移植组(术后30 d在创伤灶注入,n=3),用微量注射针将干细胞悬液注入到猴脑皮质损伤灶.同时设置对照组(n=1),在动物的左侧皮层制作创伤灶并按上述方法注射含同样浓度BrdU的神经干细胞培养液0.5 mL,右侧皮层注入干细胞悬液.移植后1、3、6个月即时移植组、延迟移植组各灌杀1只食蟹猴,移植后6月灌杀对照组食蟹猴,做移植区组织切片染色检查.结果 即时移植组和延迟移植组都可观察到脑皮层创伤灶内有棕褐色的BrdU标记阳性细胞,而对照组组织切片中则未见BrdU阳性表达细胞.移植后BrdU阳性表达细胞早期呈簇状分布,随后散在分布,6个月后细胞形态多样.移植后6个月在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞.结论 移植的骨髓源性神经干细胞在脑皮层创伤灶内有存活并可向邻近区域迁移.     

共转染EGFP和hMnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力的影响

目的：人正义、反义MnSOD基因和EGFP共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察MnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力和报告基因表达的影响。方法：应用NucleofectorTM核转染仪将人正义、反义MnSOD基因和荧光真核表达载体共转染体外培养的恒河猴骨髓源神经干细胞，荧光显微镜下观察荧光蛋白在细胞内的表达，并检测转染细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果：①转染24h后，共转染细胞可见荧光蛋白在骨髓源神经干细胞内有效表达，荧光显微镜下发强绿色荧光，其转染率约为80％。②转染人正义MnSOD基因的细胞的总SOD活性[(8．03&;#177;0.74)NU／mg]与转染人反义MnSOD基因细胞的总SOD活性[7．19&;#177;0．86)NU／mg]差异无显著性意义，但MnSOD活性前者明显高于后者1．89倍。结论：MnSOD基因与EGFP基因共转染骨髓源神经干细胞，均有效表达，提高了细胞内MnSOD活性，为多基因联合治疗帕金森病提供了可行的技术平台。     

人骨髓来源的多能成体祖细胞分离纯化及体外培养的实验研究

目的：建立体外分选纯化人多能成体祖细胞(muhipotent adult progenitor cills from bone marrow，MAPCs)的方法，用自行配制的细胞培养基对MAPCs进行体外培养，了解其生长、增殖特性。方法：取健康志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞，对单个核细胞行贴壁培养后，将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45，Gly-A免疫微磁珠负分选，流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度；培养观察细胞生长情况，对传代到不同阶段的细胞进行流式细胞分析，初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性。结果：①通过免疫磁性分离(magnetic activated cell sorting，MACS)分选，平均每1&;#215;10^9L^-1骨髓贴壁细胞可分选出约(5．1&;#177;2．8)&;#215;10^7L^-1数量级的MAPCs，分选前后细胞活力分别为(96．7&;#177;1.7)％和(96．0&;#177;2．4)％，差异无显著性意义。②用自制的培养基培养分选后的MAPCs，细胞生长良好，最长传代到第16代。③流式细胞仪分析获取的CD45^-，Gly-A^-细胞纯度大于98％；流式细胞仪分析传代第4，8，12代MAPCs，CD45^-，Gly-A^-细胞纯度大于98％。结论：①CD45，Gly-A免疫微磁珠负分选可从骨髓细胞中分选出高纯度的MAPCs。②自行研制的人MAPCs培养基能成功体外培养MAPCs。     

人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法:无菌取成人髂骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bonemarrowstroualcells,BMSCs);在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞,通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定;通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力。结果:分离得到的成人BMSCs培养10～14d后,细胞呈半贴壁状,胞体饱满,Nestin抗原染色阳性。培养20d后,在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs),具有细长双极或多极突起,神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性。HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE,经体外诱导培养8,11d的神经干细胞、体外诱导分化20d的NLCs均可检测到NE,神经干细胞(8,11d)的NE含量为(10.4146±1.0425),(28.3359±3.8371)μg/L小于NLCs(20d)组(52.1342±3.9136)μg/L,差异有非常显著性意义(F=126.64,P=0.0000)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,人BMSCs可被成功诱导为神经细胞,并具有合成分泌神经递质成分的能力。     

自体骨髓源神经干细胞移植加矫形手术治疗脑性瘫痪上肢重度痉挛性畸形1例：2年随访

目的：观察应用矫形手术，自体骨髓源神经干细胞移植并正中神经部分切断方法治疗重型脑性瘫痪上肢痉挛患儿，探讨其在降低肌张力的同时，提高肌力和手指功能的修复作用。方法：选择广东省第二人民医院2002—02确诊为重型脑性瘫痪后遗右上肢肘、腕关节严重痉挛和屈曲挛缩畸形的患者1例。男，12岁，病程12年。采用韦氏儿童智力量表评定患儿智商为55分（90～109分为平常；80～89分为低于平常；70～79分为边界；〈69分为智力缺陷），应用巴氏指数（共10项，每项10分，评分越高，日常生活自理能力越强）评估患儿残疾自理能力45分，左上肢可支撑协助爬行。右上肢肌张力Ⅲ级，肘关节屈曲挛缩45&;#176;，腕关节屈曲挛缩105&;#176;，右腕骨质轻度畸形，右手不能持匙和分指。双下肢肌张力Ⅲ级，髋、膝、距小腿（踝）关节均有屈曲挛缩。对此患儿的治疗方案监护人知情同意。采用矫形手术：①上肢矫形手术：行屈腕屈指肌起点下移和尺侧屈腕肌腱背移；②术后2个月行右上肢正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植。自患儿右髂后上棘取骨髓12mL，用梯度密度离心法获取骨髓基质细胞，接种于含维甲酸和碱性成纤维细胞生长因子的神经干细胞培养基中，连续培养11d后移植。取右腋窝纵切口，显露正中神经后切开神经外膜，将正中神经在神经外膜内切断一半，缝合外膜将培养好的干细胞注入外膜内，周围用凝胶海绵包埋，滴2mL神经节苷脂于凝胶海绵上，逐层缝合切口。治疗后采用改良Ashworth评定标准评定肌张力（0级：无肌张力增加；Ⅰ级：肌张力轻度增加；Ⅱ级：肌张力较明显增加；Ⅲ级：肌张力严重增高：Ⅳ级：强直）。结果：①上肢矫形手术2个月后复查右上肢，屈肘屈腕挛缩好转，但屈肘屈腕肌痉挛状态无改善，右手指随意伸屈功能无好转。②由于屈肘屈腕挛缩有复发趋向，因此决定行右上肢正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植。移植术③后1周、2周、1个月时检查右上肢屈肘、屈腕、屈指肌张力低于正常，右手腕屈曲和手指屈曲肌力下降到Ⅱ级，正中神经支配区域感觉迟钝。但肘关节屈曲挛缩和腕关节屈曲挛缩均消失，右手也不能持匙，不能分指，手指不能夹纸。3个月后右上肢屈肘、屈腕、屈指肌张力，以及右手腕的屈曲和抓握肌力开始恢复。18个月后右手腕和手指屈曲肌力达到Ⅳ级，可持匙进食，可夹纸，肌张力和感觉基本正常，患儿可扶单拐行走，右上肢屈肌痉挛状态未见复发，2年后复查右手腕指屈伸功能仍在改善中。结论：本例脑性瘫痪患者所致肘、腕关节严重痉挛和屈曲挛缩，行正中神经部分切断和自体骨髓源神经干细胞移植后，不但降低了屈肌痉挛的状态。而且改善了正中神经部分切断后腕手指屈曲无力和感觉异常。说明此方法不仅有利于周围神经横断缺损感觉运动功能的修复，而且对肌痉挛状态具有较好的作用。     

多巴胺受体功能与癫痫的相关研究前沿

多巴胺是中枢神经系统的单胺类神经递质之一,参与多种神经活动的调节。在过去30年中,多巴胺系统一直是许多研究的焦点,它参与了癫痫活动的调节。多巴胺的不同作用是由特异的受体来介导,多巴胺受体分为D1与D2两个亚群。D1亚群包括D1和D5,D2亚群包括D2,D3和D4。D1类受体的存在使兴奋性氨基酸如谷氨酸的神经毒性加强,使γ-氨基丁酸(GABA)浓度降低,同时,可能通过钙离子的内流增加,使动作电位后出现持续性去极化状态,从而使癫痫活动得以加强。D2类受体拮抗兴奋性氨基酸及毒蕈碱所致的兴奋性神经毒性从而降低癫痫的发生。D1与D2类受体参与癫痫的调控都与多巴胺在颅内的传导通路有关。     

神经移植的种子细胞：大鼠骨髓基质细胞部分生物学特性

目的：分离培养SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cebls，BMSCs)，观察BMSCs部分生物学特性。方法：实验于2004—03／08在珠江医院广东省神经医学研究所实验室进行。采用密度梯度离心法分离BMSCs，MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞生长周期、鉴定细胞表面标志，免疫荧光染色观察细胞的神经分化功能及端粒酶反转录酶(TERP)表达。PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果：①采用密度梯度离心法可以得到高纯度的BMSCs，表达CD29，CD44等表面标志，而不表达CD3l，CD34，CD45。②BMSCs主要由Ⅰ，Ⅱ型两种形态的细胞组成，其中Ⅱ型细胞表达端粒酶活性并可以诱导分化为Nestin阳性细胞。③骨髓基质细胞原代培养时增殖能力较低。结论：BMSCs主要有两种形态和功能不完全相同的细胞类型组成，其中Ⅱ型细胞具有端粒酶活性，并在一定的诱导条件下可以分化为Nestin阳性细胞，可以考虑作为神经移植的种子细胞来源。     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的：探讨兔骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞，能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法：分离兔BMSCs，应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化，免疫细胞化学鉴定；并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果：BMSCs培养12d可见大而圆细胞，免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性；培养20d可见长突起神经元样细胞，神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性，高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质，经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为：每1&;#215;10^7细胞中(1．7940&;#177;0．0095)，(4．010&;#177;0．1170)μg／L，差异有非常显著性意义(t=30．6323，P=0．001)。方差分析显示：随着骨髓基质细胞培养天数的增加，其所含的5-羟色胺浓度也渐增加，组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P＜0．01)。结论：兔BMSCs能在体外增殖，并表达Nestin抗原；而且，在适宜条件下能分化成神经元样细胞，并表达成熟神经元特异性核蛋白，合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化

目的:建立外伤性癫痫的铁离子诱导细胞模型,观察N-乙酰半胱氨酸及德巴金预处理对受氯化亚铁作用的皮层神经元过氧化物及膜电位的影响。方法:实验于2004-10/2005-06在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成。①培养的新生SD大鼠神经元细胞,随机分为5组:对照组,模型组(1mmol/L),N-乙酰半胱氨酸预处理组(终浓度0.08g/L);丙戊酸钠(德巴金)预处理组(终浓度0.1g/L);N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组(终浓度分别为0.08g/L及0.1g/L)。②采用荧光探剂DiBAC4(3)和乙酰乙酸盐2’,7’二氯氢化荧光素分别标记,激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)断层光切扫描动态观察体外培养的大鼠脑皮层神经元受氯化亚铁作用时的细胞膜电位和过氧化物水平变化。③免疫组织化学检测核因子-κB的表达情况。结果:①大鼠脑皮层神经元过氧化物水平:与对照组比较,模型组过氧化物的相对荧光强度值著性增高(3.39±1.21,18.95±16.26,P=0.038<0.05);N-乙酰半胱氨酸预处理组及N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组相对荧光强度变化呈负值(-19.66±10.40,-14.84±5.08),与模型组比较差异有显著性(P<0.01);德巴金预处理组(22.89±0.91)相对荧光强度变化与模型组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。②各组细胞膜电位测定结果:德巴金预处理组及N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组相对荧光强度值明显低于模型组(-11.18±3.12,4.45±1.69,25.15±8.84,P<0.01);而N-乙酰半胱氨酸预处理组相对荧光强度变化(23.13±18.92)与模型组差异无显著性意义(P>0.05)。③模型组较对照组核因子κB染色强度明显增加;N-乙酰半胱氨酸预处理组与N-乙酰半胱氨酸 德巴金预处理组较模型组染色强度明显降低。结论:氯化亚铁对皮层神经元的作用可导致过氧化物的生成,导致膜电位的改变,N-乙酰半胱氨酸预保护可减少其过氧化物等自由基的生成,德巴金可起到稳定皮层神经元膜电位的作用,两者共同预处理可显著减轻皮层神经元受氯化亚铁作用的损伤。抗氧化剂联合抗癫痫药可能有助于防治与铁剂诱发有关的癫痫发作。     

大鼠海马CA3区内神经元和星形胶质细胞的空间形态

背景：星形胶质细胞能够积极参与脑内的神经活动，与神经元之间存在双向的空间信息联系。目的：观察大鼠海马CA3区神经元锥体细胞及其周围星形胶质细胞的分布，重塑两之间的三维构象。设计：以实验动物为研究对象，随机对照的实验研究。单位：一所大学医院的神经外科、一所军医大学的神经科学研究所。材料：实验2001-10／2003-06在南方医科大学珠江医院神经外科和解放军第四军医大学全军神经科学研究所完成。出生30d的SD雄性大鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：采用脑片膜片钳全细胞记录、细胞内荧光黄染色、免疫荧光和激光共聚焦显微镜相结合的技术。主要观察指标：主要观察神经元的放电类型及其周围星形胶质细胞的空间分布。结果：根据放电形式的不同主要把海马锥体细胞分为两类：位相型和非位相型放电神经元。激光共聚焦显微镜下单层光学图像和三维立体重建显示许多星形胶质细胞紧密围绕在细胞内荧光黄染色锥体细胞周围并形成紧密接触。两类神经元与星形胶质细胞形成接触的部位存在区别。非位相型放电神经元的树突和胞体周围都有许多星形胶质细胞形成接触的部位，而位相型放电神经元则仅位于树突。结论：不同特性海马神经元周围星形胶质细胞的空间分布可能存在差异。