定点突变提高Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶催化活性

通过分析超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶基因,对6个可能提高酶催化活性的氨基酸残基进行定点突变,获得比未突变酶催化活性较高的突变子Y184H、Y121S、A109V、K98R、V125L。将以上5个突变位点集中在一个突变子上得到突变酶TSAM-23,该突变酶与未突变酶相比,酶的催化效率有较大提高,酶的活力和90℃条件下的热稳定性分别提高了3.75倍和2.4%,最适反应pH值为5.0,比未突变酶降低0.5,较之突变前有更好的工业应用价值。     

海洋低温α-淀粉酶酶解豌豆淀粉及其生物活性

豌豆淀粉是一种广泛用于食品加工的重要的食品原料,采用研制的新型海洋低温α-淀粉酶,结合单因素试验和正交试验优化了α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的工艺参数,并对酶解产物的生物活性进行了研究。结果表明,低温α-淀粉酶酶解豌豆淀粉工艺条件为加酶量35 U/g,时间165 min,温度35℃,豌豆淀粉浓度4%,pH6.5。经高效液相色谱(HPLC)分析,酶解产物中麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖的总和达到65.88%。酶解产物对羟自由基和DPPH自由基均有清除作用,对DPPH自由基的清除效果好于对羟自由基的清除效果。为豌豆淀粉的深入加工提供了参考。     

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高温普鲁兰酶基因的克隆及表达

根据NCBI 上公布的普鲁兰酶基因的保守序列设计简并引物,以Thermococcus siculi HJ21 基因组DNA 为模板进行PCR,得到T. siculi HJ21 普鲁兰酶的基因,测序后通过Blast(NCBI)数据库比对和分析表明扩增基因有一个4056bp、编码1351 个氨基酸的开放阅读框,为一新的普鲁兰酶基因。将该基因插入表达载体pET28a,并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG 诱导,测定普鲁兰酶比活力。重组转化子的细胞破碎液有高温普鲁兰酶活性,SDS-PAGE 电泳结果显示出分子质量约为150kD 的特异性条带。     

耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05的筛选、鉴定及酶学性质研究

目的:从燕尾港受污染海域筛选耐有机溶剂蛋白酶产生菌,确定该菌的分类地位,并对其所产溶剂稳定性蛋白酶的酶学性质进行研究。方法:通过在培养基中添加20%(V/V)甲苯作为筛选压力,筛选耐有机溶剂极端微生物,通过产蛋白酶筛选培养基筛选产蛋白酶的菌株,并利用摇瓶发酵进行复筛,最后对产酶菌株进行鉴定并对粗酶的性质进行测定。结果:筛选获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05,结合16S rDNA序列分析、形态学观察和生理生化性质将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该酶的最适反应温度和pH分别为50℃和10.0,Cu2+、Mn2+对酶有激活作用,Mg2+、Fe3+和Ba2+对酶具有抑制作用。在50%乙醇中,25℃、140 r/min振荡72 h后仍能保持50%以上酶活力。结论:分离获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌解淀粉芽孢杆菌菌株MSP05,对有机溶剂具有较好的耐受性,具有潜在的工业应用价值。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp．G23产低温淀粉酶发酵条件的研究

从江苏连云港海域筛选和分离到1株产低温淀粉酶的海洋细菌Pseudoaiteromonassp.G23,对该菌株进行了产a-淀粉酶发酵条件研究,结果表明,该菌株发酵16 h后到达产酶高峰,最适产酶温度为15℃,最适产酶pH值为8.5,装液量为20%.可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨促进产酶.利用响应面方法对菌株Pseudoalteromonassp.G23产α-淀粉酶的发酵条件进行了优化,结果表明,可溶性淀粉浓度为1.16%、蛋白胨浓度为2.11%.发酵温度12.38℃,酶活为41.4U/mL,较优化前提高了7倍.     

超声波提取雪莲薯多糖工艺优化及其对羟自由基的清除

以雪莲薯为原料,通过单因素和正交试验研究超声波提取多糖的工艺条件。结果表明,最佳提取工艺条件为提取时间15min、提取温度50℃、超声波功率80W、料液比1:30(g/mL),雪莲薯多糖得率为53.3%。提取效果影响大小的先后顺序为提取时间＞提取温度＞提取功率＞料液比。未脱蛋白多糖对羟自由基有较强的清除作用,IC50 为1.82mg/mL。脱蛋白后多糖对羟自由基清除作用得到显著的提高,IC50 为0.085mg/mL,比未脱蛋白多糖的清除作用提高了20 余倍。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.G23产低温淀粉酶发酵条件的研究

从江苏连云港海域筛选和分离到1株产低温淀粉酶的海洋细菌Pseudoalteromonas sp.G23,对该菌株进行了产α-淀粉酶发酵条件研究,结果表明,该菌株发酵16h后到达产酶高峰,最适产酶温度为15℃,最适产酶pH值为8.5,装液量为20%。可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨促进产酶。利用响应面方法对菌株Pseudoalteromonas sp.G23产α-淀粉酶的发酵条件进行了优化,结果表明,可溶性淀粉浓度为1.16%、蛋白胨浓度为2.11%,发酵温度12.38℃,酶活为41.4U/mL,较优化前提高了7倍。     

固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化菜籽油制备生物柴油稳定性的研究

研究了固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化菜籽油制备生物柴油的反应,探索了酶的预处理方式、后处理方式、反应温度、甲醇的加入方式等对酶活稳定性的影响。结果表明：将酶在油酸甲酯中浸泡0.5h,过滤后用菜籽油淋洗,在菜籽油中浸泡12h可以提高酶活的稳定性;多批次反应温度40℃为适宜;用丙酮洗涤酶除去甘油可以提高酶的稳定性;分三步加入甲醇的方式可以减轻甲醇对酶的毒害。Lipozyme TL IM经过预处理,40℃下进行多批次反应,每批反应24h,并在反应0、8、16h时加入1摩尔当量甲醇,并在8、16h以及反应结束时用丙酮洗涤固定化酶并重新投入体系,连续反应10批次,Lipozyme TL IM相对酶活仍有85%.     

超嗜热古菌Thermococcus sp．HJ21产高温α-葡萄糖苷酶条件和酶学性质初步研究

对1株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了产α-葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究。结果表明,该菌株发酵时间为6h时,较适合产胞内α-葡萄糖苷酶,发酵时间为21 h时较适合产胞外α-葡萄糖苷酶。其最适产酶温度为85℃,pH为6.5,NaCl浓度为2.5%。可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶。该酶的最适作用温度为100℃,90℃半衰期(t_(1/2))为2h。最适酶作用pH值为7.0,在pH值5.0～8.0酶活力相对稳定。金属离子Cu~(2+)、Al~(3+)、Ni~(2+)对该酶有较明显抑制作用,Hg~(2+)几乎完全抑制该酶的活性,而EDTA、Fe~(3+)和K~+对该酶有激活作用。     

产黑芥子酶鞘氨醇杆菌属菌株RJ35的筛选、鉴定及酶学性质

从油菜田的土壤中筛选到1株产黑芥子酶菌株RJ35，对其进行形态学与分子生物学鉴定，并对RJ35产的黑芥子酶进行纯化和酶学性质研究。菌株鉴定结果显示RJ35为鞘氨醇杆菌属。通过超滤浓缩及凝胶层析对黑芥子酶进行纯化，结果显示该黑芥子酶分子质量约为100 kDa。酶学性质研究结果显示该黑芥子酶的最适pH值和最适温度分别为7.5和40℃，且金属离子对其无显著激活作用。高效液相色谱测定结果表明该黑芥子酶可水解萝卜种子提取物产生萝卜硫素。当粗酶液在最适条件下水解萝卜种子提取物30 min时，萝卜硫素产率可达5.95 mg/g（占种子提取物质量计）。本研究结果为微生物源黑芥子酶的开发及应用奠定了实验基础。