正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以假俭草叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2 、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对假俭草SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了假俭草的SRAP最佳反应体系.结果表明,假俭草SRAP-PCR最佳反应体系为:2 μL 10譖CR buffer、60 ng模板DNA、Mg2 1.50 mmol/L、dNTP 260 μmol/L、引物0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20 μL.各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2 浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小.运用该体系对4份假俭草种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从45个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合.这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行假俭草分子遗传学研究提供了科学依据.     

结缕草属优良品系SSR指纹图谱的构建

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合快速银染检测,从45对Xgwm系列SSR引物中筛选出2对产物清晰、稳定的引物,建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱,并借鉴常规植物分类法,以品系的特征带为依据,从分子的角度将它们与生产上的主栽品种‘马尼拉’、‘青岛结缕草’和‘兰引3号’结缕草区分开来。最后利用统计软件SPSS 10.0通过欧氏平方距离法进行聚类分析,将14份参试材料分为3组。     

结缕草属草坪草种质资源的耐盐性评价

 以相对绿叶盖度和相对枝叶修剪干重为指标,通过水培法系统地对７种１０３份结缕草属种质资源用２０ｇ／ＬＮａＣｌ进行耐盐性评价。结果表明,供试材料间的耐盐性差异很大。以相对绿叶盖度进行比较,比‘马尼拉’和‘兰引３号’强的材料各有２８份和４６份;以相对枝叶修剪干重为指标,比‘马尼拉’和‘兰引３号’强的材料各有１１份和２５份。供试材料种间耐盐性最强的为太平洋结缕草,大穗结缕草、沟叶结缕草和细叶结缕草的耐盐性也较强,中华结缕草、结缕草和朝鲜结缕草的耐盐性中等或较弱。以相对绿叶盖度和相对枝叶修剪干重为指标对１０３份结缕草属种质资源进行聚类分析,将１０３份结缕草属种质资源分成三大类,其中Ⅰ 类为极耐盐类型,包括Ｚ５１８５和Ｚ０９３两份材料;Ⅱ类的相对绿叶盖度和相对枝叶修剪干重的平均值均较高（＞７０％）,进一步分为耐盐、中等耐盐２ 类;Ⅲ类相对绿叶盖度和相对枝叶修剪干重的平均值较低,在欧式距离３处将Ⅲ类分为弱耐盐、盐敏感２类。     

假俭草杂交后代生殖性状遗传及相关性分析

选用假俭草2份生殖性状存在差异的种源材料E102和E092(1)进行杂交,获得F₁分离群体,应用植物数量性状主基因＋多基因混合遗传模型分析方法对F₁群体的花序密度、生殖枝高度、每穗粒数和花序长度等生殖性状进行遗传分析,已初步明确假俭草上述性状的遗传特性。结果表明,1)在调查的杂交后代的4个生殖性状中,变异系数由大到小依次为花序密度(54.10%)>生殖枝高度(13.17%)>每穗粒数(8.92%)>花序长度(8.42%),变异系数最大的为花序密度,最小的为花序长度。2)花序密度的最佳遗传模型为A-4模型,即一对主基因模型,该主基因表现为负向完全显性,即显性效应等于负的加性效应,主基因遗传率为60.71%。生殖枝高度的最佳遗传模型为B-1模型,即2对主基因,加性－显性－上位性模型,主基因遗传率为93.73%。花序长度也是B-1模型,主基因遗传率为96.79%。每穗粒数最佳遗传模型均为A-0模型,即无主基因模型。性状间相关分析结果表明,叶片长度与叶片宽度、叶片长度与草层高度之间呈极显著的正相关,相关系数分别是0.417 8和0.628 5;生殖枝高度与花序密度、生殖枝高度与每穗粒数之间呈显著的正相关,相关系数分别为0.374 8和0.356 2;生殖枝高度与草层高度之间呈极显著正相关,相关系数为0.423 0。     

结缕草的抗寒性与体内碳水化合物、脯氨酸、可溶性蛋白季节动态变化的关系

为了阐述结缕草抗寒性与碳水化合物、脯氨酸含量及可溶性蛋白含量季节动态变化的关系,在2008年10月-2009年5月期间,以‘兰引3号’结缕草(Zoysia japonica ‘Lanyin No.3’)为材料,研究在自然温度变化过程中,‘兰引3号’结缕草地下根茎碳水化合物、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量的季节性动态变化及其与LT₅₀变化的关系。结果表明,在越冬前后,‘兰引3号’结缕草地下根茎LT₅₀呈先降低后升高的季节变化趋势,可溶性总糖含量、蔗糖含量、果糖含量及可溶性总糖/淀粉、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量伴随田间气温变化均呈先升高后又降低的趋势,淀粉含量则呈先降低后又升高的趋势;‘兰引3号’结缕草地下根茎LT₅₀季节变化与可溶性总糖含量、果糖含量、可溶性总糖/淀粉、可溶性蛋白含量季节变化之间显著负相关,而与蔗糖含量、淀粉含量、脯氨酸含量的季节变化间不存在显著的相关性。     

辐射技术在国产狗牙根育种中的初步应用

利用不同剂量γ辐射线不同种源的国产狗牙根进行处理。分析引进表明：①从种的水平上，狗牙根匍匐茎γ射线的半致死剂量为９０００ｒａｄｓ。②不同种源对不同剂量γ射线反应不同，处理后所有种源节间变细，但幅度不同，在６．７～２６．７％之间，高剂量处理使狗牙根节间缩短６．１％～２６．５％，叶片变短２１．８％～５２．１％，但在叶宽性状上变异方向不一，其变幅为－１５．４％～１１．８。低剂量处理对不同种源生产反应不同     

我国狗牙根种质资源匍匐性的研究

利用草坪草匍匐性的量化指标-形态指数对我国狗牙根种质资源匍匐性进行了研究和评价.结果表明,我国狗牙根种质资源形态指数变异系数为48.5%,种源间形态指数差异极显著,并且随纬度增大呈显著减小趋势(y=0.706-0.024x),而随经度增大呈增大趋势(y=0.371+0.0024x).多重比较结果表明,C191、C297及C219的形态指数显著高于Tifway.     

狗牙根种质资源营养生长特性差异的研究

本研究选取水平扩展系数、水平生长速率、垂直生长速率、单位周长匍匐茎数和最长匍匐茎长度5个指标,对不同地理分布的33份国内外野生狗牙根种源和源自中国、澳大利亚和美国的22份狗牙根品种之间的营养繁殖差异进行初步评定,以明确中国狗牙根种质的营养繁殖。结果表明,国内外狗牙根之间表现出丰富的多样性,变异系数在35.10％~82.31%,平均为57.26%,国内狗牙根种源之间差异较大,且国内种源变异范围大于国外狗牙根品种,国内狗牙根种源和育种材料的垂直生长速度明显低于国外品种;相关指标间除垂直生长速率外都存在着极显著相关性,相关系数最高达到0.957;通过SPSS 13.0软件进行聚类,55份代表性狗牙根种源(品种)被分为3大类,即匍匐茎快速繁殖型、中间型和匍匐茎慢速繁殖型,其中,匍匐茎快速繁殖型均为中国本土种源。     

结缕草属植物杂交育种及其杂种鉴定——同工酶的变异分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对结缕草属14个杂交组合的亲本与后代的过氧化物酶与酯酶酶谱进行分析,结果表明:1)结缕草属植物在后营养期有20条迁移率不同的过氧化物酶酶带与19条迁移率不同的酯酶酶带,据酶带的相对迁移率及其分布特点将过氧化物酶酶谱分为A、B、C三个区,酯酶酶谱分为A、B、C、D四个区;2)结缕草的杂交后代在酶带数目以及酶带活性强弱方面与双亲存在较大的差异,而且还出现了数量不等的双亲所没有的“特征酶带”;3)在所鉴定的44个后代中,有25个后代具有父本的特征带,2个后代具有其他任何材料均没有的一条特征带,这27个后代可以初步鉴定为真杂种。     

结缕草属植物SRAP－PCR体系的建立和优化

以ＳＤＳ法提取的结缕草属植物叶片ＤＮＡ 为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验２种方法,对影响结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的MG²⁺ 、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶和模板ＤＮＡ 五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用Ｌ１６（４５）方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据４对引物对６ 份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,２种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析２种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的最佳反应体系：MG²⁺２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ,总体积为２０μＬ。这一优化体系的建立为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。