副猪嗜血杆菌分离株的耐药性及耐药基因分析

为了解浙江省规模化猪场患病猪副猪嗜血杆菌的耐药性,采用K-B琼脂法对73株HPS浙江株进行了18种临床药物的敏感性试验,同时应用PCR技术对11个相关耐药基因进行扩增、测序和比对分析。药敏试验结果显示：对磺胺类耐药的分离株比例高达86．30％,对四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类和氯霉素类耐药的比例分别为65．75％,60．27％,50．68％,50．68％,46．58％,对大环内酯类耐药仅为28．77％。 PCR分析显示：97．26％的菌株中检测到耐药基因,多重耐药的占84．93％。其中喹诺酮类耐药基因Aac（6′）-1b的检出率为76．71％,氨基糖苷类耐药基因AadA1的检出率为65．75％,磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率为45．2％和10．96％,氯霉素类耐药基因Flor、CmLA、Cat1的检出率为15．07％,8．22％,58．9％,四环素类耐药基因 TetA和 TetB 的检出率为4．11％和49.32％,β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为35．62％,大环内酯类耐药基因ErmB的检出率为1．37％。耐药基因型和表型符合率为：磺胺类62．07％,β-内酰胺类74．29％,氯霉素类81．48％,四环素类75.00％,大环内酯类0,喹诺酮类75．68％,氨基糖苷类72．09％。因此,HPS在浙江规模化猪场对临床药物已产生了耐药性,通过耐药基因检测结果确定耐药菌株具有一定的参考价值。     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌热休克蛋白70基因的序列分析及抗原性鉴定

本研究利用简并引物首次从副猪嗜血杆菌基因组DNA中克隆获得全长HSP70基因(登录号:EU69-3116),基因测序结果表明HSP70完整阅读框1 908 bp,根据编码序列推导出相应635个氨基酸.经BLAST分析表明,其氨基酸序列与溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等同源性最高,达到90%左右.将HSP70部分基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.SDS-PAGE表明表达的重组蛋白约46 l(u,将表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清.Western blot结果显示该融合蛋白与副猪嗜血杆菌人工感染猪血清以及原核表达蛋白免疫的小鼠抗血清反应后有明显的特异性条带,证明该重组蛋白具有良好的抗原性,为HSP70功能研究奠定了重要基础.     

2008-2011年浙江省猪主要病毒性疫病病原流行病学调查

为了解浙江省猪主要病毒性疫病的流行动态,采集近4年来临床病猪病料1118头份,采用PCR和RT-PCR方法进行猪主要病毒性疫病的病原检测.结果显示,PRRSV,CSFV,JEV,PCV2,PRV,PPV,PEDV和TGEV病原的平均感染率分别为51.71％,15.71％,27.16％,50.8％,1.99％,84.4％和9.0％.其中PRRSV,CSFV和PCV2每年都有较高的检出率,仍是浙江省猪场的主要病原;PRV和PPV近年来流行有所下降,该病已得到较好控制;2011年初发现流产病例中JEV的检出比例有明显升高,检出率高达39.29％;2011年2月在刚出生仔猪腹泻病例中PEDV检出率大大提高,造成严重损失.总之,浙江省猪场中PRRSV,CSFV和PCV2仍是防控的重点,但多病原感染或新变异株的出现也是近年来浙江省猪疫病复杂化的主要原因之一.     

猪源结肠小袋纤毛虫培养、分子鉴定和显微观察

小袋纤毛虫病是一种人畜共患寄生虫病。本研究从浙江地区病猪盲肠内分离到了一株结肠小袋纤毛虫,通过RPMI1640培养基对其进行了体外培养,结肠小袋纤毛虫在28℃和37℃均能良好生长,在培养后第5天和第4天分别达到高峰值,虫体密度分别为1.60×104和2.31×104个·m L-1。显微镜下滋养体胞口、胞肛和食物泡结构明显,DAPI染色后大核明显呈哑铃型,且滋养体有大小差别明显的2种类型。18S r RNA基因PCR扩增、测序和聚类分析结果显示,猪源结肠小袋纤毛虫分离株存在2条明显不同的18S r RNA基因序列,序列间趋异性为0.6%,且该分离株序列与国外分离株间存在显著差异,在进化树上形成一独立的亚枝。在高倍显微镜下,滋养体内常见有许多生物活动,种类不明,16S r RNA基因PCR扩增到3条未知细菌序列,未知细菌16S r RNA基因序列与结肠小袋纤毛虫内微生物间的确切关系有待研究。     

副猪嗜血杆菌CDT毒素的生物学功能分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种常见的猪(Susscrofa domestica)致病菌,其细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)被认为是一种重要的毒力因子,为进一步明确CDT的一些生物学及免疫学特性,本研究经体外组装获得了高纯度的CDT三聚体完整毒素,研究三聚体蛋白对Marc145及仔猪外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBLC)的毒性作用,明确CDT三个亚基的特异性抗体对其细胞毒性的阻断作用.原核表达的3个CDT亚基经过共折叠形成了稳定的三聚体蛋白,能诱导Marc 145细胞产生典型的细胞病变.CdtB及CdtC的兔抗血清对CDT完整毒素具有中和作用,且CdtC的兔抗血清可以更有效地阻断CDT的细胞毒性作用,最大中和效价为1:16,而CdtA亚基的兔抗血清无中和作用.CDT可以抑制丝裂原活化的仔猪PBLC增殖作用.致病菌株及非致病菌株分泌蛋白中CDT的滴度一致,均为l:512.本研究结果表明,副猪嗜血杆菌CDT具有明显的免疫抑制作用,可能对于该菌在宿主体内定殖以及引起宿主系统感染至关重要,但并非造成不同菌株致病力显著差异的原因.本研究为揭示副猪嗜血杆菌的致病机理提供了重要信息.     

浙江省猪源产肠毒素大肠杆菌分子流行病学调查

本研究旨在调查浙江省猪源产肠毒素性大肠杆菌的流行情况和毒力基因特征。采用标准细菌学方法对大肠杆菌进行分离,并用聚合酶链反应(PCR)方法检测大肠杆菌的毒力基因。2014-2021年共分离到137个携带ETEC黏附素或肠毒素基因的大肠杆菌菌株,其中禁抗后平均每年分离到的菌株数量是禁抗前的2倍。肠毒素基因检测结果表明,STb (129/137,94.2%)最常见,其次是STa (64/137,46.7%)和LT (62/137,45.3%);黏附素基因以F18 (56/137,40.9%)最占优势,其次为K88 (28/137,20.4%),未检测到K99和987P及F41等黏附素。上述137个临床分离株中共检测到16种不同的毒力因子模式,平均每8.6个菌株产生一种不同的毒力因子模式;其中39.4%的菌株仅携带肠毒素基因,检测不到经典的黏附素基因,而1.5%的菌株则与之相反。共有81株菌同时检测到肠毒素和黏附素基因,占检出总数的59.1%。在所有被检测的生长阶段,肠毒素STb均为检出率最高的肠毒素,且随着日龄增加检出率逐渐降低。黏附素F18随着仔猪日龄的增加检出率不断提高;K88黏附素在各...     

副猪嗜血杆菌OMP P2基因PCR检测方法的建立与应用

通过反应条件的优化、特异性和敏感性的测定,建立了一种快速、简便、准确的PCR方法,用于检测副猪嗜血杆菌(HPS)OMP P2基因。PCR扩增片段大小为1 080 bp左右,最小检测量为1 000个HPS。与胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无特异性反应。用该法检测人工感染猪的肺脏、心脏和肾脏抽提的DNA,结果为阳性;检测肝脏、脾脏、脑组织样品抽提的DNA,结果为阴性。用该法检测人工感染发病仔猪及自然感染仔猪肺组织,并结合细菌分离培养,证明以肺脏组织为病料,通过细菌分离培养,再用PCR法鉴定分离菌体,可有效地用于HPS的特异诊断。检测116份来自发病猪场的患病仔猪肺脏病料,其中有110份为阳性,与16S rRNA PCR检测结果一致,表明HPS所致发的Glsser's病已在我国广泛发生和流行。     

免疫刺激商品断奶仔猪复制多系统衰竭综合征(PMWS)

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起PMWS的必需病原,与其他病原混合感染或受到外界刺激时表现PMWS临床症状。本试验将16头商品化断奶仔猪（32日龄）随机分为4组（每组4头）,即对照组、钥匙孔血蓝蛋白刺激组、PCV2攻毒组和PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组,用上海某猪场分离株PCV2-SH、钥匙孔血蓝蛋白（KLH）反复刺激断奶仔猪以复制PMWS。其中对照组、钥匙孔血蓝蛋白刺激组未出现症状;PCV2攻毒组症状较轻,出现增重缓慢,伴有短暂的体温升高;而PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组出现明显的临床症状,2头猪在攻毒后第11天濒临死亡,其中1头在第12天死亡,攻毒猪宰杀后脏器出现明显的病理变化。PCV2攻毒组和PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组于攻毒后第4天出现病毒血症,宰杀后肺脏、淋巴结均检测到PCV2的DNA。以上结果说明,PCV2-SH感染结合免疫刺激可以引起商品化仔猪发生PMWS,为PCV2致病机理和免疫学研究提供了动物发病模型。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位对鸭禽流感疫苗的免疫效果

从大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的生物安全性、对鸭的毒副作用以及对鸭禽流感疫苗免疫增强效果等方面进行研究,结果表明,LTB制品中未检测到自身编码基因和抗性标记基因残留;高剂量LTB能诱导产生抗LTB自身抗体,并与剂量呈正相关;当使用剂量增大至50 mg/kg时,试验鸭表现出一定的神经症状及组织学病变;肌肉注射1 mg/kg LTB可显著提高禽流感灭活疫苗免疫鸭的血凝抑制(HI)抗体滴度。研究表明LTB具有增强禽流感疫苗免疫效果的潜力,且对鸭的安全使用剂量不超过50 mg/kg。