猪流行性腹泻病毒N重组表达蛋白间接ELISA检测方法建立

为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。     

副猪嗜血杆菌不同分离株CDT基因序列测定及其遗传变异分析

CDT毒素是多种革兰氏阴性致病菌的毒力因子.为了阐明CDT毒素在副猪嗜血杆菌不同菌株中的分布及其遗传变异情况,本试验对从浙江省不同地区猪场临床发病猪中分离到的41个副猪嗜血杆菌分离株进行了CDT基因PCR扩增,并对其中21个分离株CDT 3个亚基进行了基因测序及氨基酸序列分析.结果表明:所有41个临床分离株中都可以检测...     

副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60 500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法(P2-ELISA),并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。     

浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%～99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%～99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PC...     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。     

副猪嗜血杆菌分离与基因分型鉴定

本研究选择6个具有明显多发性浆膜炎等症状的猪场,从患猪肺支气管中分离获得6株副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs),采用RFLP-PCR针对tbpA基因进行基因型鉴定。结果显示,6个分离株属于4种不同的HPs基因型,证明我国HPs流行株存在多种基因型,采用PCR-RFLP分析副猪嗜血杆菌流行病学规律,具有实用意义。     

中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser's病的不同猪场的111株副猪嗜血杆茵进行了指纹鉴定.结果显示:111株分离株显示出23种指纹图谱,前3种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR X X(20/111),X X ⅢⅠ(9/111)和Ⅳ(8/111).且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱.该试验表明,ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定;试验结果还揭示了副猪嗜血杆茵在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型.     

副猪嗜血杆菌四环素耐药基因TetB的PCR检测方法建立

在本实验室前期研究的基础上,选取与四环素耐药表型相关性较好的TetB基因,建立PCR方法,以探索副猪嗜血杆菌耐药性的快速检测方法。本研究利用四环素主要耐药基因TetB的引物,对PCR反应条件进行优化,以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板,未出现非特异性扩增条带,PCR扩增条带单一。将TetB基因克隆至pMD 19T载体,以重组质粒为标准品,确定了最低检测拷贝数,经测定,最低检测拷贝数为154×103。以不同稀释度的21A7菌株基因组DNA为模板,确定了最低细菌检出量,经测定,最低检测细菌数量为46×103个。该方法为建立临床快速检测副猪嗜血杆菌耐药性奠定了基础。     

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用

通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

副猪嗜血杆菌毒力与非毒力菌株菌体蛋白的比较蛋白质组学分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪群上呼吸道的一种共栖菌群,在一定的条件下能侵入机体并导致严重的全身性疾病,区分出正常栖生菌株和致病性菌株是确诊该病的关键.为了筛选副猪嗜血杆菌毒力株与非毒力株之间的差异蛋白,本研究通过比较蛋白质组学分析临床分离的毒力菌株14A7-2和非毒力菌株20A3-2之间2-DE图谱的差异,提取两个菌株的菌体蛋白进行双向电泳分离,Imagemaster 2D Platinum 7.0软件分析处理凝胶图像,MALDI-TOF/MS鉴定差异蛋白.在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中表达量差异达5倍以上及毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点共有80个.选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白.其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种,在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等.研究结果为进一步研究副猪嗜血杆菌的毒力因子和致病机理以及鉴别诊断不同毒力株新技术提供新信息.