重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

西藏林芝地区土壤水分特征曲线适用性研究

西藏地区自然气候特征、成土母质和成土条件有着显著的地区特性,了解西藏高原地区土壤水动力学特性对于研究高原地区水文和水循环过程具有重要的意义。2015年分别在林芝地区米林县(海拔2 905 m),八一镇(海拔3 240 m)和林芝县(海拔3 879 m)3个青稞种植区田间取样,在原状土土壤水分特征曲线测试的基础上,研究了西藏林芝地区土壤基质势和土壤含水率之间的关系,并建立了参数的微分求解方程,发展了土壤水分特征曲线非线性函数的参数估计方法;基于实测值构建Jacobi矩阵,采用全局性最优方法确定了van Genuchten模型和Gardner-Russo模型的参数。结果表明,-11.0~-4.0、-42.0~-11.0 k Pa以及-54.0~-42.0 k Pa基质势区段的单位基质势平均含水率变化量分别为5.4×10-3、11.2×10-3和6.7×10-3cm~3/(cm~3·k Pa),最大差异性发生在-54.0~-42.0 k Pa之间,西藏地区的土壤水分特征曲线形状主要决定于黏粒质量分数,而砂粒质量分数则主要影响土壤水分特征曲线的变异性。van Genuchten模型和模拟6组试验数据的相对误差平均值和最大值分别为0.04和0.09。采用Gardner-Russo模型模拟6组试验数据的相对误差的平均值和最大值分别为0.06和0.14。van Genuchten模型模拟西藏林芝地区的土壤水分特征曲线的精度及有效性显著超过Gardner-Russo模型。     

水稻灌区农业面源污染物迁移转化规律模拟研究

模拟水稻灌区中非自然水文过程及其驱动下的面源污染物迁移转化过程对了解水稻灌区面源污染形成机理以及污染控制具有重要的意义。将水稻灌区水文过程分为陆面水文过程和排水沟道水文过程,采用均衡法模拟陆面水文过程中稻田深层渗漏水量以及氨氮(NH4~+)、硝氮(NO_3~-)和磷酸根(PO_4~(3-))的渗漏通量,在此基础上,基于非稳定饱和渗流方程计算稻田深层渗漏过程所形成的侧向排水过程,作为排水沟道水文过程的输入项,基于动力波方程和一阶动力学方程描述了水稻灌区排水网络下的面源污染物运移和转化过程,提出了水稻灌区农业面源污染物迁移转化模型。根据前郭灌区2008—2009年的监测数据对模型渗流过程、主要面源污染物迁移转化过程参数进行率定,采用2010年的监测资料对模拟结果进行了验证。结果表明,基于所提出的方法模拟了稻田和排水沟道2个水文过程中NH4~+,NO_3~-和PO_4~(3-)的质量浓度峰值过程的差异,实现了水稻灌区陆面水文和排水沟水文过程的耦合。稻田水层中模拟NH4~+,NO_3~-和PO_4~(3-)的Nash-Sutcliffe系数分别为0.772、0.758和0.709,相对均方根误差(RMSE)分别为0.042、0.050和0.071,排水系统中模拟NH4~+、NO_3~-和PO_4~(3-)污染物的Nash-Sutcliffe系数分别为0.645、0.704和0.854,相对均方根误差(r RMSE)分别为0.072、0.060和0.031。所提出的方法可有效地模拟稻田渗流过程和排水过程中的面源污染物迁移转化过程。     

番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立

根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011~2012采集的224份(番鸭74、鹅68、鸭82)疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%(44/74),11.0%(9/82)和4.4%(3/68),表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。     

浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析

为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株 ALV-J,并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示:在检测的19个地方鸡品系中,所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性,其中101系的抗体阳性率最高,母鸡阳性率为40.48%,公鸡阳性率为16.54%;126系次之,母鸡阳性率为28.87%,公鸡阳性率为3.30%;171系抗体阳性率最低,其母鸡阳性率仅为4.08%,公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异,对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明,5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp,与预期一致;本研究样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%~98.5%,与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%~97.0%,与国内其他分离株的同源性为86.5%~99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高。结果表明:浙江省大部分地方品种鸡都不同程度感染ALV-J,而且分离毒株已经发生了不同程度的变异,提示我们应加强浙江省地方品种鸡ALV的净化工作。     

经营性建设用地征地补偿方式探究-土地权益入股

研究目的:通过分析经营性建设用地征地补偿实行土地权益入股的可行性和实行此种方式应具备的条件,为完善中国征地制度,保护失地农民利益提供一种思路。研究方法主要是文献资料法和理性分析法。研究结论:从理论常识、法律依据、企业需求、农民需求、政府等方面分析对经营性建设用地征地补偿方式实行土地权益入股是可行性的,并提出了实行此种方式应具备的基础条件、前提条件、技术条件和法律保证。     

鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析

根据GenBank中已发表的鸭瘟病毒TK基因序列,设计一对引物,对1株鸭瘟病毒强毒和1株鸭瘟病毒疫苗毒进行PCR扩增。将扩增的目的片段分别克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒,然后对阳性重组质粒进行序列测定及分析。结果表明,本实验所扩增的鸭瘟病毒TK基因及侧翼UL24基因大小为1 995 bp,鸭瘟强、弱毒株TK基因及侧翼UL24基因序列完全相同,该病毒TK基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911509与AY963569,四川株DQ640611,AV1221株EF173464,sd-01株EF417996同源性分别为99.5%,99.9%,100%,99.9%,100%,而该病毒UL24基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911511,DQ227739,EF417996同源性为99.9%,99.8%,99.9%,表明鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守。为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础。     

鹅与番鸭溃疡性胃肠炎病原的分离鉴定

从患以胃肠道出血、溃疡为主要特征的急性、败血性传染病发病死亡的鹅和番鸭病料中各分离到 1株病毒 ,DQ和DQ M。病毒分离物对鸡胚、番鸭胚、鹅胚和番鸭均具有极强的致病性。血清学实验结果表明 ,DQ和DQ M属于禽Ⅰ型副粘病毒     

鹅病流行特点与防控对策

一．鹅病流行特点 随着规模化养鹅业的发展,疫病危害日渐突出,疫病流行呈现出一些新特点。     

鸭出血性卵巢炎的初步研究

2010年6月以来,我国部分地区所饲养的种鸭和蛋鸭发生一种疾病,以突发产蛋急剧下降为特点,根据病变,暂将该病称为鸭出血性卵巢炎(duck hemorrhagic ovaritis,DHO)。从不同地区的发病鸭群采集34份样品,取15份样品进行病毒分离,获得10个鸡胚分离物和5个鸭胚分离物。RT-PCR检测结果表明,15个分离物均为禽流感阴性,14个分离物为新城疫阴性。选分离株YY5株进行了电镜观察和PCR排查,结果表明,该毒株的毒粒直径为40~50 nm,呈鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒PCR阴性,但为黄病毒RT-PCR阳性。基于黄病毒NS1序列合成引物,用RT-PCR检测15株病毒分离物和其余19份临床样品,黄病毒阳性率为82.4%。用YY5株的221-nt NS1序列进行分析的结果显示,YY5株与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)的巴格扎病毒(Bagaza virus)具有相近的遗传进化关系,但遗传距离介于病毒种的水平。用一株鸭胚分离株感染91日龄临近开产的麻鸭和232日龄的产蛋麻鸭,可复制出卵泡膜出血的病变。结果表明,从DHO自然病例分离到一种新的黄病毒,暂称为鸭黄病毒(duck flavivirus,DFV),DFV可能与DHO有关。