sacB介导的绿针假单胞菌YL-1遗传操作方法

绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis YL-1是从大豆根围分离获得的,对多种病原细菌和病原真菌有较强抑制作用。为了探明绿针假单胞菌YL-1生防相关基因的功能,本研究以嗜铁素转录调控因子PvdS编码基因为对象,建立了一套基于负选择标记基因sacB的绿针假单胞菌无标记基因敲除技术,构建重组质粒pEX18-pvdS,通过改良的细菌接合转移技术将重组质粒导入野生型菌株YL-1中,利用同源重组技术获得缺失突变株ΔpvdS。生防相关性状研究结果表明,与野生型菌株YL-1相比,突变株ΔpvdS泳动能力和生长能力未发生改变,但是群集运动能力显著下降。同时突变株ΔpvdS合成嗜铁素的能力也显著下降,pvdS基因互补后突变株能恢复合成嗜铁素的功能。本文结果表明,已成功建立了适用于YL-1的基因定向敲除技术和功能基因互补体系,为深入研究YL-1的生防机制奠定了重要基础。     

转运蛋白MoMfs2对稻瘟病菌细胞壁完整性和杀菌剂外排的调控

【目的】稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上一种最具破坏性的真菌病害,严重威胁我国的水稻生产安全。研究转运蛋白MoMfs2编码基因MoMFS2(MGG＿01301)在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能,为开发新型杀菌剂提供参考。【方法】利用基因敲除策略将其进行缺失突变并对突变体进行了一系列的生物学表型分析。【结果】实验显示该突变体无论在自然培养基还是在合成培养基上,生长速率较野生型均没有变化,表明MoMFS2基因不参与稻瘟病菌对营养的吸收利用;另外,该突变体原生质体释放速度变慢,对细胞壁胁迫因子刚果红和SDS耐受性显著增强,表明该基因参与了对细胞壁胁迫的应答,进一步推测其在稻瘟病菌细胞壁完整性发挥重要作用。此外,该突变体不能在含有刚果红和ABTS平板上产生晕圈,同时其对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌显著降低,表明MoMfs2参与了对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌;另外该突变体对不同类型的杀菌剂(咪鲜胺、多菌灵、和嘧菌酯)敏感性显著增强,表明该突变体对杀菌剂的耐受性降低,推测MoMFS2基因参与了稻瘟病菌对杀菌剂的外排。通过水稻喷雾和大麦离体致病性测定发现该突...     

细菌性条斑病菌致病力分化及其对水稻幼苗和成株的致病力差异

对来源于湖南、江西、云南、江苏和安徽省的71株细菌性条斑病菌菌株,通过采用苗期注射接种和成株期针刺接种法,分别研究了它们在6个鉴别水稻品种(金刚30、IRBB4、IRBB5、IRBB14、IRBB21和IRBB24)上致病力分化及其对水稻幼苗和成株致病力差异,为品种布局和条斑病菌致病力快速鉴定提供理论依据.试验结果显示...     

井冈霉素和生防菌Bs-916协同控病作用及增效机理

为了解决枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis生防菌株Bs-916在大面积推广应用中存在着田间防治效果不稳定、药效作用缓慢等问题，将井冈霉素和生防菌Bs-916对半混合使用。试验结果表明：井冈霉素和生防菌Bs-916协同作用防治水稻纹枯病有显著的增效作用。用Bs-916利福平抗药性标记回收法测定了井冈霉素和Bs-916复配后Bs-916在水稻根叶围的定殖状况，表明井冈霉素对Bs-916在水稻根叶围定殖有促进作用，能减缓Bs-916群体数量大幅度下降，并使Bs-916发挥生物防治作用。这是井冈霉素和枯草芽孢杆菌Bs-916协同作用的增效机理之一。     

黏质沙雷氏菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因,大小为1 692 bp,推测其编码一条长563个氨基酸的多肽链,分子量约为60 900。同源分析研究结果表明从C8-8中克隆的chiA基因序列与黏质沙雷氏菌株141(DQ 990373.1)和14041菌株(DQ 493896.1)的chiA基因序列相似性最高,达到99%。结构域分析结果表明从C8-8中克隆的chiA基因N末端(23 AA)存在典型的信号肽序列,C端存在另外两个结构域,即PKD区(73 AA)和几丁质酶催化区(387 AA)。采用大肠杆菌表达系统重组表达chiA基因,结果表明重组菌株在几丁质诱导培养基上能产生透明的水解圈。采用SDS-PAGE电泳分析,结果表明chiA重组表达产物的相对分子质量约为60 000,与预测分子量大小基本一致。初步提纯后,生物活性试验结果表明该重组表达产物能水解几丁质,在几丁质培养基上产生透明的水解圈。     

枯草芽孢杆菌Bs-916草酸脱羧酶基因Bacisubin的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析

为明确枯草芽孢杆菌生防菌株Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin的编码基因,并初步解析Bacisubin的抑菌机理,根据该蛋白质的部分序列设计简并引物,获得了编码基因的部分序列,参考基因组数据库克隆了Bacisubin基因全序列。将Bacisubin基因克隆至PET28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达获得His标签融合蛋白质,并利用次甲基蓝-重铬酸钾法初步检测了该融合蛋白质的酶催化活性。克隆获得Bacisubin基因开放阅读框序列共1 161 bp,G+C含量为51.3%,可编码386个氨基酸,编码蛋白质与Bs-168菌株的草酸脱羧酶Yvrk蛋白质的氨基酸相似度为87%,与其他多种细菌和真菌的草酸脱羧酶的N端和C端Cupin活性中心区域和Mn2+结合区域高度保守。预测Bacisubin分子量为43 600,等电点为5.18,是较稳定的可溶性草酸脱羧酶,其催化最适pH为6.0左右,最适温度为30℃左右。说明枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin为草酸脱羧酶,抑菌作用可能与其降解草酸的能力有关。     

具抗水稻白叶枯病新基因的新种质及其利用

运用细胞突变体离体筛选技术,以感白叶枯病的杂交稻恢复系"明恢63"的成熟胚为外植体,诱导筛选育成抗白叶枯病突变品系"HX-3".     

江苏省部分稻区恶苗病菌对水稻浸种剂的抗药性检测

水稻恶苗病 (病原菌ＦｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｍｅＳｈｅｌｄ)是水稻生产中主要的种传病害 ,受其危害后水稻在苗期和生长期均可表现为徒长、矮化、死苗等症状。近几年来由于优质高产品种和新栽培技术的大面积推广应用 ,水稻恶苗病的发生有一定的加重趋势。通过种子处理 ,病害可得到有效控制。但由于水稻长期使用某些浸种剂 ,病原菌对其抗药性增强 ,长期使用 ,最终使浸种剂杀菌能力降低 ,甚至失去抑菌作用[1～ 3 ] 。本研究拟通过检测采自江苏省通州、常熟、吴江等地区的田间恶苗病菌株对施宝克、浸种灵和多菌灵的抗药性 ,以期了解恶…     

杀虫晶体蛋白基因CrylAc在生防菌B-916中的表达

枯草芽孢杆菌生防菌B-916对水稻纹枯病和稻曲病具有良好的防治效果，为拓宽其防治范围，兼治病虫害，本研究采用B-916内源芽孢形成期特异表达启动子成功实现了杀虫晶体蛋白基因CrylAc在野生型生防菌B-916的高效表达，成功构建了兼治水稻病、虫害的工程菌E-916。经SDS—PAGE电泳分析，异源CrylAc基因在对数生长后期其表达产物杀虫晶体蛋白占到胞内总蛋白的28％。杀虫和抑菌试验结果表明构建的工程菌对水稻二化螟具有杀虫活性，且保持了其原有对水稻纹枯病的拮抗性能。构建的工程菌具有良好的分离稳定性，连续培养25h，稳定性高于95％；连续培养50h稳定性高于70％；连续稀释培养50h，质粒丢失频率为每代小于10^-3个。     

拮抗细菌C8-8培养条件的研究

就拮抗细菌C8-8的最适培养条件进行了研究。结果表明,在NA培养基上,拮抗细菌C8-8的最适培养温度为30～35℃,最适pH值范围为7.0～8.0;培养时间、初始接种量对菌株C8-8的生长有明显的影响,培养27 h后菌液OD值最高;最佳初始接种量应是培养液体积的0.5/300～1/300;不同通气量对菌株生长无明显影响。