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为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%~90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。 相似文献
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猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立 总被引:7,自引:0,他引:7
根据已发表的PCV—1和PCV-2全基因组序列,设计了3条引物,组成PCV-2的特有引物对和PCV-1、PCV-2的共有引物对,分别扩增长度为472bp和339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性,将472bp的扩增产物纯化后,克隆到pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定,并测序。将该序列递交NCB1进行BL-AST同源序列比较,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV-2毒株核苷酸序列的同源性均在99%以上,与PCV—1毒株的同源性为86%。结果显示,该方法最少可用于3μg病料组织和0.75pg DNA的PCV-2检出.具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市47份“猪高热综合征”病料,PCV-2感染阳性率为36.17%,PCV—1单独感染阳性率为34.04%。 相似文献
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根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD18-T载体,进行测序;将△Cap基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,△Cap融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的22.1%。 相似文献
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网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1~1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的16S rRNA基因(DQ201403、AY785244)具有较高的同源性(99%),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602。结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudo monas putida)。药敏试验结果表明,病原菌GYCWS对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氟派酸、四环素、链霉素药物敏感。 相似文献
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阴沟肠杆菌B8是从水稻叶面分离获得的具有拮抗水稻白叶枯病菌等多种病原细菌的广谱拮抗菌.为研究其拮抗机理,我们应用转座子标签法对阴沟肠杆菌B8中与抗水稻白叶枯病菌拮抗活性相关的DNA片段进行了克隆.通过自杀性质粒pZJ25介导,将Tn5转座到B8的染色体上,从而筛选到2株拮抗活性丧失的菌株B8B和B8F;用Tn5片段为探针,分别对B8、B8B、B8F进行Southern杂交,结果在B8中无特异条带,而在B8B和B8F中各有一条约20kb和9kb的EcoRⅠ特异条带;分别提取二株突变菌株的基因组DNA,BamHⅠ酶切,克隆于pBS的BamHⅠ位点上,利用Tn5上的Kan抗性,分别筛选到质粒pTLB和pTLF,获得包含Tn5部分序列的B和F二个基因片段,大小约为6kb和7kb;应用pTLB全质粒和pTLF中约0.8kb的BamHⅠ+HpaⅠ外源F片段为探针,对B8、B8B、B8F进行Southern杂交,证实我们克隆到Tn5转座位点周围的二个片段,且他们分别位于B8菌株染色体DNA的二个不同位置. 相似文献
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杭州某牧场一鸡群发生具有强烈呼吸症状的传染病,对病死鸡剖检见明显肾肿大、出血、花斑等肾病变,在临床初步诊断的基础上进行了病原分离及病原特性的初步测定,进一步证实该鸡群发生了具有明显呼吸症状及肾病变二种病型的呼吸、肾病变兼型传染性支气管炎。 相似文献