禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立

为建立一种能快速检测鸡传染性贫血病毒病（CIAV）的检测方法,根据基因库中鸡传染性贫血病毒病的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了CIAV的LAMP可视化检测方法。该法敏感性可迭10fg,高于常规PCR方法10倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸡常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于CIAV感染的快速检测。     

基于纳米材料的电化学免疫传感器检测H5N1亚型禽流感病毒的研究

利用氧化石墨烯(GO)负载H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体(PAb-H5N1)及牛血清白蛋白(BSA)作为信号放大材料,构建一种新型电化学免疫传感器用于检测H5N1亚型禽流感病毒。结果表明:以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器的灵敏度比不用此纳米复合物作为信号放大的高256倍。以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器对H5N1亚型禽流感病毒的检测限为2-15 HA unit·50μL-1,检测线性范围为2-15～2-8 HA unit·50μL-1。此传感器特异性好,灵敏度高,在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。     

禽呼肠孤病毒δ2基因的真核表达及其免疫效果研究

采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARV S1133毒株和广西分离株R1的δ2基因,将δ2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,对获得的重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定.结果表明,插入的片段为δ2目的基因,插入的位置、大小和阅码框架均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒peDNA-S1133-δ2、...     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒 三重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix Taq~(TM)12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。     

广西鸭源H3N8亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

[目的]了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。[方法]将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚,应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定,然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列测定和遗传进化分析。[结果]血清学及HA和NA基因测序结果显示,该分离毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/duck/Guangxi/446D28/2021(H3N8)。全基因遗传进化分析显示,其HA蛋白无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;NA蛋白出现耐药性氨基酸位点突变;该毒株8个基因片段在GenBank中比对分析结果显示,其同源性最高的毒株基本主要来自越南和位于我国候鸟迁徙路线上的宁夏及江西等省(区)。[结论]该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过相互基因交换所形成的基因重组体。