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SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立 总被引:1,自引:1,他引:1
为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。 相似文献
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鸡马立克氏病胚胎免疫的研究 总被引:1,自引:1,他引:0
用MD京CV1988/Rispens冷冻疫苗对孵化至18日龄的鸡胚进行免疫接种,试验结果表明:胚胎免疫不影响孵化率,对鸡的生长发育也无影响,与1日龄免疫的雏鸡比较,可明显提高对MD强毒攻击的抵抗力。 相似文献
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构建一种新型电化学免疫传感器用于检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),为BVDV提供一种新型快速的检测方法。利用甲壳胺(Chi)修饰石墨烯(G)并负载金纳米粒子(AuNP),得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNP)纳米复合物用于修饰金电极,然后固定抗BVDV NS3蛋白单克隆抗体,构建BVDV电化学免疫传感器。所构建的电化学免疫传感器对BVDV的检测敏感度为10~(1.2) TCID_(50),特异性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛分支杆菌(MB)、牛冠状病毒(BCV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。研究建立的BVDV电化学免疫传感器具有特异性好和灵敏度高的优点,在BVDV快速检测领域具有良好的应用前景。 相似文献
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根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明:E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。 相似文献
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根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。 相似文献
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目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8~10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。 相似文献
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根据Genbank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的半套式PCR方法.该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与实验设计相符的228 bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.01 fg的折光马尔太虫质粒DNA.用该半套式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫7份,结果提示福建沿海养殖的贝类中存在折光马尔太虫感染,建立的半套式PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测. 相似文献
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