牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立

用兔抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)多抗作为包被抗体,BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体,建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法,对各项反应条件进行优化,最终获得最佳工作条件为兔多抗1∶1 600稀释包被,NS3单抗1∶2 000稀释,酶标抗体工作浓度为1∶4 000稀释。特异性和敏感性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无特异性交叉反应,其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量,与RT-PCR方法的相比较,符合率为100%。所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感,可用于BVDV抗原的检测。     

广西鸡源肠炎沙门氏菌的分离与鉴定

对广西壮族自治区3个鸡场疑似沙门氏菌感染发病鸡进行细菌分离,并对分离菌株进行染色镜检、生化实验、血清学鉴定、DNA测序、动物回归试验和药敏试验。结果共分离到6株沙门氏菌,生化特征和血清学特征符合肠炎沙门氏菌特性;DNA测序结果与肠炎沙门氏菌同源性为100%;动物回归试验表明,分离菌株能致死SPF鸡,并复制出与临床表现一致的病例;药敏试验结果表明,分离菌株对诺氟沙星和阿米卡星高度敏感,为广西地区鸡源沙门氏菌病的防治提供参考依据。     

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒（AIV）的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型（723 bp）和N2亚型（314 bp）AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

7种食源性致病菌GeXP多重PCR检测方法的建立及其应用

本研究旨在建立一种能够同时鉴别包括大肠杆菌O157：H7、沙门菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌7种常见食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法。根据这些致病菌在GenBank上公布的保守基因序列,设计合成了7对特异性GeXP引物。用单一或混合细菌样品的DNA模板优化反应条件,设置对照组,构建重组质粒,随机组合不同浓度的样品,验证所建立的GeXP方法的特异性、敏感性和准确性。最后用该方法检测120份临床样品,进一步验证所建立的GeXP检测方法的准确性和可靠性。结果显示,单一或混合模板的GeXP检测均能特异性出现相应清晰峰值,可在10³拷贝·μL^-1水平上同时特异地检测出7种细菌病原体,不同浓度模板混合时,本试验所建立的方法依然可检测出对应病原体。检测120份临床样品,GeXP多重PCR阳性率为2.50%（3/120）~15.83%（19/120）,普通PCR阳性率为2.50%（3/120）~15.00%（18/120）,GeXP多重PCR多检出8份阳性,表明GeXP方法更为敏感与准确。本研究建立的同时鉴别7种食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法,具有高通量、特异性强和敏感性高的特点,为食源性常见致病菌感染或混合感染提供了快速分子诊断方法。     

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒（CSFV）及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据GenBank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性（翠绿色）,其他非CSFV样本的检测结果均为阴性（桔红色）,且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。     

禽呼肠孤病毒σNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究

表达并纯化了禽呼肠孤病毒(ARV)的2个非结构蛋白σNS和P17,并以此作为包被用抗原,分别进行间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度分别为9.3μg/mL和11.5μg/mL;一抗血清的稀释度都是1∶200;HRP酶标二抗羊抗鸡IgG稀释度为1∶5 000,初步建立了能检测ARV感染的σNS-ELISA、P17-ELISA方法。以σNS、P17两种蛋白按以上确定的条件同时包被,建立了σNS-P17-ELISA。分别用σNS-ELISA、P17-ELISA及σNS-P17-ELISA对接种过ARV活病毒或灭活疫苗的33份SPF鸡血清进行检测,结果发现以非结构蛋白建立的3种ELISA方法均能区分ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的抗体,进一步对这3种方法进行敏感性、特异性分析比较,表明σNS-P17-ELISA方法能更有效地区分ARV感染与灭活疫苗免疫抗体。