广东省SARS流行株M基因序列分析

目的：测定广东省不同流行时期13份SARS病毒(SARS CoV)标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。方法：提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。结果：13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99．7％～100％，M基因核苷酸序列只在2个位点(80和203位)发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸(F)变为半胱氨酸(C)，3株203位变化为无义突变。结论：M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。     

广东省信宜市蚊媒种类密度初步调查

目的 调查广东省信宜市怀乡镇和水口镇蚊媒数量及种类分布。方法 怀乡镇检查猪场、猪栏和牛房中蚊媒的分布；水口镇以牛诱和猪栏检查的方法调查蚊媒的分布。于19：00～21：30点观察蚊媒出现的情况，并以捕蚊管捕捉蚊媒。对所捕按蚊进行计数、分类。结果 共捕获蚊媒602只，其中包含5个种：骚扰阿蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、多斑按蚊和嵌斑按蚊。三带喙库蚊为当地的优势蚊种，其占除阿蚊外总蚊量的90．8％。结论 三带喙库蚊为信宜市的优势蚊种。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT-PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法.方法 设计合成LNA探针,替代MGB探针,建立一步法TaqMan RT-PCR方法,并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化;用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA,以优化的TaqMan RT-PCR方法进行检测,比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性.结果 LNA探针TaqMan RT-PCR有较好的PCR扩增效率(104%)、较广的线性范围(10 0～10-7样品稀释度)、较高的敏感性(0.003TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于4.53%),新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性(0.03TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于6.36%).结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT-PCR反应,简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT-PCR可满足登革病毒快速检测的需要.     

2018-2019年广东口岸入境发热人员常见呼吸道病原体感染调查

目的 了解广东口岸入境发热人员呼吸道感染情况.方法 采集2018-2019年广东口岸出入境发热人员的鼻咽拭子样本,用实时荧光定量PCR (RT-PCR)的方法检测21种/型呼吸道病原体,包括流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、腺病毒、人鼻病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体等.结果 2018-2019年共采集13 436人份鼻咽拭...     

中国云浮口岸蚊媒病毒的首次调查

目的 掌握云浮国境口岸蚊类携带重要蚊媒病毒的现状,探讨提高口岸蚊媒病毒检测有效性的方法,为预防和控制口岸蚊媒传染病的发生提供科学依据。方法 于2011年5月~11月在云浮口岸捕捉活蚊,对蚊标本研磨液提取核酸后应用多重实时荧光RT-PCR技术快速筛查蚊类携带的登革热病毒、日本脑炎(乙脑)病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒。对实时荧光RT-PCR检测核酸阳性的标本进行PCR扩增和序列分析。结果 在云浮共采集39 254只蚊虫,鉴定后分为460组。经实时荧光RT-PCR检测,14组蚊虫乙脑病毒核酸阳性,其余病毒(登革热病毒、乙脑病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒)均为阴性。PCR扩增和序列分析显示云浮乙脑病毒属于基因Ⅰ型。所捕获的三带喙库蚊的最小感染率为0.937‰比中华按蚊的0.385‰稍高。结论 本研究首次在云浮口岸进行大规模系统的蚊媒病毒调查,云浮口岸的蚊虫很可能没有携带登革热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒,但有少数蚊虫携带乙脑病毒。此次调查检出的基因Ⅰ型乙脑病毒是广东省内的首次报道,为今后蚊媒病毒的媒介监测检测工作提供了有效方法。虽然蚊虫最小感染率的差别没有统计学意义,但是蚊媒病毒病的暴发和流行风险仍然存在。     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。     

多种病毒集合检测芯片的研制及其在临床血清标本检测中的初步应用

目的 研制黄热病、西尼罗热、登革热、基孔肯雅热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等多种病毒性传染病集合检测基因芯片,并建立一种适用于直接检测核酸含量较低临床血清标本的新型芯片靶基因扩增标记方法.方法 设计并筛选出上述病毒70mer寡核苷酸特异探针各20条,打印于同一基因芯片上；以phi29 DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行临床标本中病毒全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物用多种病毒芯片进行杂交检测.结果 检测1～4型登革热、基孔肯雅热病例临床血清标本,结果显示该方法准确、特异、敏感；检测西尼罗热、黄热病、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等病毒核酸的模拟血清标本,同样得到特异的阳性杂交信号,与预期结果一致.结论 本研究建立的多种病毒集合检测基因芯片及其靶基因扩增标记方法,可直接应用于血清标本中上述病毒核酸的检测.     

媒介动物(蚊、猪)体内黄病毒分子流行病学调查研究

〔目的〕通过对珠海注册养猪场及珠海口岸地区的蚊虫体内黄病毒的带毒率、宿主动物(猪群)及其人群进行血清黄病毒类(日本脑炎、登革热等)抗体水平的调查研究,为控制黄病毒在人群中的流行提供科学依据。〔方法〕采集养猪场猪血清、养猪场和口岸蚊标本、养猪场从业人员、入境的东南亚船员和城区部分发热病人血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测猪群和人群血清中的日本脑炎、登革热抗体;使用紫外灯诱蚊法在养猪场和口岸捕捉蚊类,经鉴定种类后,按20只蚊一组制成蚊悬液后,采用细胞培养、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及荧光定量PCR技术检测蚊体内日本脑炎病毒、登革和西尼罗病毒等黄病毒的携带情况。〔结果〕1.猪血清日本脑炎病毒IgG抗体:结果已发表于《中国国境卫生检疫杂志》2007年第3期《珠海市部分注册猪场日本脑炎调查研究》。2.蚊媒带毒情况检测:2005年1月～2006年12月共捕获的2763只成蚊,经鉴定隶属4属8种,其中白纹伊蚊所占比例最高(32.75%),其次为致倦库蚊(26.06%)、三带喙库蚊(25.30%)、海滨库蚊(7.75%)、中华按蚊(3.84%)、骚扰阿蚊(3.18%),其他(常型曼蚊和巨型阿蚊等)(1.12%);在132组蚊研磨液的病毒细胞培养中,有7份标本出现CPE病变,使用黄病毒通用引物,RT-PCR反应能扩增出相应的阳性条带,其中白纹伊蚊组阳性3份,致倦库蚊组阳性3份,三带喙库蚊组阳性1份,但用日本脑炎病毒、登革病毒Ⅰ～Ⅳ型和西尼罗病毒等特异性引物,未能扩增出相应的阳性条带,说明可能存在着其它黄病毒类的病毒感染;采用荧光定量PCR法,对蚊悬液和细胞培养液日本脑炎、登革和西尼罗病毒进行检测,从1组海滨库蚊标本中检出日本脑炎病毒核酸阳性,但强度较弱,这与珠海地区是乙脑低发地区相一致。3.人群登革热和日本脑炎血清抗体检测:从东南亚的入境船员、本地发热病人和养猪场从业人员等血清标本511份中,登革病毒抗体IgG总阳性率为7.24%,其中以东南亚的入境船员的阳性率最高,为12.76%,没有检出登革病毒抗体IgM和日本脑炎IgM抗体。〔结论〕珠海地区存在日本脑炎的主要传播媒介,并且在蚊媒中携带有日本脑炎病毒;蚊标本细胞培养出现细胞病变和RT-PCR扩增出黄病毒基因的特异性片段,提示在捕获蚊标本中可能存在着其他病毒感染的可能;虽然养猪场猪群日本脑炎感染率不高,但存在着日本脑炎病毒的隐性感染或曾经感染过,提示不能够放松对乙型脑炎的预防控制工作,应采取积极的预防措施,防止人群和猪场日本脑炎的发生与流行。此外,研究结果表明东南亚船员有较高的登革热感染率,因此,在登革热流行期间,我国口岸应加强对来自东南亚国家交通工具员工和旅客的登革热的监测,以及有可能藏带、孳生蚊虫的废旧物品、集装箱等的检验检疫工作,以防止登革热的传入与流行。     

全国首例输入性基孔肯雅病的实验室诊断

目的:通过系统的实验室检测发现并确认全国首例输人性基孔肯雅病例.方法:利用实时荧光RT-PCR、RT-PCR检测方法,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定.结果:实时荧光RT-PCR、RT-PCR两种实验方法,在同一病例不同时间采集的多份标本中,都检测到基孑L肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行测序,测出的521个碱基与基孔肯雅病毒核酸序列比对,结果同源性高达99%.结论:该病例为全国首例输入性基孔肯雅病实验室确诊病例.