人脐血非造血干细胞的基本特性

目的：通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测，探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性，为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。 方法：实验于2005-01／10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养，记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。 结果：①人脐血非造血千细胞形态观察：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^6细胞密度接种则在48-72h后出现贴壁的梭形细胞：培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性：人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快，随后的几天内保持较快的增殖速度，15d后进入平台期。高糖DMEM培养基＋胎牛血清和高糖DMEM培养基＋胎牛血清＋白血病抑制因子，两种培养体系在细胞增殖上未显示差异，白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型：新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞，CD90，CD166阳性细胞比例分别为（24．18&;#177;5．46）％和（36．44&;#177;6．26）％；人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞，CDl66阳性细胞的比例达（76．48&;#177;4．54场，较单个核细胞中CDl66阳性细胞比例明显增高，并且表达HLA-ABC，而少量表达HLA-DR。 结论：合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞．     

Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化为多巴胺能神经元

目的 研究Desert Hedgehog(DHH)对胚胎中脑神经前体细胞(NPCs)向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法 大鼠DHH病毒上清感染COS7、NIH/3T3和9L细胞, 用免疫荧光、实时定量PCR和Western blot方法检测DHH表达。分离培养大鼠胚胎中脑神经前体细胞，免疫荧光鉴定神经前体细胞的增殖分化特性。条件细胞表达DHH成功后分别与上述NPCs共培养10d，免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果 DHH在COS7、NIH/3T3和9L细胞中成功表达；同时，分离培养的大鼠胚胎中脑神经前体细胞具有良好的增殖分化特性，但两者共培养10d后偶见TH阳性的细胞。结论 DHH编码的蛋白不能或不能单独诱导与其共培养的NPCs定向分化为多巴胺能神经元。     

氧化过氧化反应结合法显示单胺氧化酶阳性神经元的研究

以氧化过氧化反应结合法显示中枢神经系统内单胺氧化酶(MAO)阳性神经元,在显示胞体、突起和纤维走行的清晰程度上优于四唑盐法。利用Clorgyline和Deprenyl分别抑制A型和B型MAO,可以选择性显示两种不同类型MAO在中枢的分布。本研究还探讨了孵育液内HRP和盐酸酪胺浓度与呈色反应的关系。     

HRP—AChE双重组化法研究大鼠脊髓小脑束乙酰胆碱酯酶阳性神经元

对脊髓小脑束各群神经元中的AChE阳性及阴性细胞加以研究。对照组2只动物分别单纯显示脊髓内AChE阳性神经元及被HRP标记的脊髓小脑束神经元。结果表明,各群脊髓小脑束起始细胞中,均含有不同程度活性的AChE。约有52％的中央颈核细胞具有较弱活性的AChE;约有55％的背核被标记神经元含有中弱活性的AChE;“脊髓边缘细胞”内有近67％的神经元具有中等以上活性的AChE。各群脊髓小脑束神经元中AChE细胞所占比例及AChE含量各有所不同,这可能与脊髓小脑各束的不同功能有关。     

猴脑内移植原代培养人胚胎骨骼肌细胞的研究

猴脑内移植原代培养人胚胎骨骼肌细胞的研究首都医科大学北京神经科学研究所张进禄刘玉军赵春礼王元身王珂徐群渊取引产的４～６个月人胚胎四肢骨骼肌，剪碎，用胰酶及胶原酶共同消化后制成细胞悬液，经梯度法离心纯化，以１×１０６细胞密度放入３５ｍｍ培养皿中。培养８...     

应用直接酪胺信号放大方法显示Y染色体荧光原位杂交信号

目的用直接酪胺信号放大(tyramine signal amplification,TSA)方法显示Y染色体荧光原位杂交信号,以提高检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度。方法以小鼠Y染色体重复序列pY353/B cDNA为模板标记RNA探针,以雌性小鼠为对照,用原位杂交方法杂交Y染色体特异性基因区域,分别用直接TSA方法和"三步抗体法"显示荧光原位杂交信号。通过计数Y染色体阳性细胞核占所有细胞核的百分率来计算TSA法和"三步抗体法"检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度,比较分析两种方法灵敏度的差异。结果"三步抗体法"在脑切片检测Y染色体阳性信号的灵敏度和特异度分别为85.67%和100%;直接TSA法在脑切片检测Y染色体阳性信号的灵敏度和特异度分别为92.82%和100%。结论TSA方法检测脑组织切片Y染色体荧光原位杂交信号的灵敏度比"三步抗体"法有显著的提高,可以用于脑内追踪和分析骨髓干细胞的迁移规律。     

大鼠Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在神经前体细胞分化中的作用

目的 探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响. 方法从大鼠脑组织中提取总BNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因在转染细胞中的过表达情况. 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定,证实目的 基因已插入重组质粒,RT-PCR证明,经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因;实时荧光定量PCR进一步证明,转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA高表达. 结论 构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆.Hes1基因高表达可抑制神经前体细胞Ngn1的表达,并促进神经前体细胞向神经胶质细胞的分化.