circRNA001131通过结合miR-25-3p抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达

目的:研究环形RNA(circRNA)001131对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)纤维化表型的影响及分子机制。方法:采用Masson三色染色法对腹主动脉缩窄(AAC)手术诱导的心肌重构大鼠心肌进行胶原纤维的染色观察。利用芯片检测AAC手术诱导的大鼠心肌中circRNA表达谱的变化。RT-qPCR检测AAC大鼠心肌及血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)诱导的大鼠CFs中circRNA001131的表达。利用放线菌素D和RNase R实验检测circRNA001131的稳定性。利用重组circRNA001131腺病毒(rAd-circRNA001131)感染大鼠CFs,检测CFs中纤维化相关基因Ⅰ型胶原α1链(Col1a1)、Ⅲ型胶原α1链(Col3a1)和肌动蛋白α2(Acta2)的mRNA和蛋白表达。双萤光素酶报告基因实验验证circRNA001131与miR-25-3p的结合作用。结果:RT-qPCR结果证实,circRNA001131在AAC手术诱导的大鼠心肌和Ang-Ⅱ处理的大鼠CFs中表达增强。放线菌素D和RNase R实验结果显示,circRNA001131与其宿主基因--第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Pten)mRNA相比,降解水平明显降低。过表达circRNA001131可显著抑制大鼠CFs中纤维化相关基因Col1a1和Col3a1的表达。双萤光素酶报告基因实验证实circRNA001131与miR-25-3p间存在结合作用,miR-25-3p可以减弱circRNA001131对大鼠CFs中纤维化相关基因表达的抑制作用。结论:circRNA001131在心肌纤维化中表达增强,并通过结合miR-25-3p发挥抑制心肌纤维化的作用。     

1,25-二羟基维生素D_3通过抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂受体表达降低足细胞活动力

目的观察1,25-二羟基维生素D_3[1,25(OH)_2D_3]对脂多糖诱导的足细胞活动力和尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)表达的影响。方法小鼠足细胞分化成熟后分为3组:正常对照组、脂多糖组(50 mg·L~(-1)脂多糖孵育足细胞24 h)、脂多糖+1,25(OH)2D3组[50 mg·L~(-1)脂多糖+1 nmol·L~(-1)的1,25(OH)_2D_3]共同孵育足细胞24 h。采用免疫荧光激光共聚焦、流式细胞术、实时荧光定量PCR、转板迁移测定法等技术,检测足细胞活动力改变以及足细胞uPAR蛋白和uPAR mRNA(Plaur mRNA)的表达。结果转板迁移测定法中每个视野细胞在正常对照组、脂多糖组、脂多糖+1,25(OH)2D3组分别为(8.4±3.8)、(31.3±7.9)、(19.2±6.8)个,脂多糖组膜下层迁移足细胞多于其他2组,脂多糖+1,25(OH)_2D_3组多于正常对照组(P<0.01)。脂多糖组uPAR蛋白荧光信号强于正常对照组,脂多糖+1,25(OH)_2D_3组弱于脂多糖组。脂多糖+1,25(OH)2D3组uPAR蛋白表达率和Plaur mRNA为(31.12±4.46)%和1.97±0.46,均低于脂多糖组[(54.66±8.69)%和3.06±0.93,P<0.05],高于正常对照组[(9.80±3.1 1)%和1.00±0.00,P<0.05]。结论 1,25(OH)_2D_3可能通过抑制uPAR的表达,降低足细胞活动力,起到保护足细胞的作用。     

环状RNA circ0036167与融合肉瘤蛋白结合发挥抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用

[目的]研究环状RNA circ＿0036167对心肌成纤维细胞纤维化表型的调控作用及可能机制。[方法]对心衰患者及器官捐献者心肌组织进行Masson三色染色以检测心肌胶原水平。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ＿0036167及其宿主MYO9A在心衰心肌中的表达。通过放线菌素D和RNase R处理实验鉴定人心肌细胞AC16中circ＿0036167的RNA稳定性。利用重组circ＿0036167腺病毒感染C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞(mCF),在RNA和蛋白水平检测纤维化相关基因COL1A1、COL3A1和ACTA2的表达。利用EdU染色和Transwell细胞迁移实验鉴定circ＿0036167对mCF增殖和迁移能力的影响。基于生物信息学预测和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证circ＿0036167与融合肉瘤蛋白(FUS)的结合作用。检测敲低mCF中FUS表达对circ＿0036167调控心肌纤维化相关基因表达的影响。[结果] Masson三色染色显示心衰心肌发生明显的纤维化(P<0.001)。RT-qPCR结果显示circ＿0036167在心衰心肌...     

Effect of allitridi on calcium current in rat ventricular myocytes

Background Allitridi is an active compound that is extracted from the garlic. It has effects of anti-atherosclerosis, anti-arrhythmias and lowering blood pressure. But the controversy about the effect on cardiac contractility still exists. Methods Whole-cell patch clamp recording technique was used to record ICa,Lin single cell isolated rat ventricular myocytes. The nifedipine- sensitive L-type calcium current was recorded in the rat ventricular myocytes. Results Allitridi decreased the calcium channel current in a dose-dependent and voltage-dependent manner in ventricular myocytes of rats. The current-voltage curve was shifted upwards, on which active potential,peak potential and reverse potential showed no significant changes. The inactivation curve was shifted to more negative potential, but the activation curve and recovery curve were not altered. Allitridi had no effect on frequent-dependency of calcium current. Conclusion These results show that allitridi could concentration-dependently decrease calcium channel current in ventricular myocytes of rats.     

miR-25-3p通过BTG2/SOD2轴促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达

目的 研究微小RNA(microRNA,miRNA)miR-25-3p对心肌成纤维细胞纤维化表型的调控及机制。方法 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)灌注小鼠构建心肌纤维化模型。用miRNA表达谱芯片检测纤维化的小鼠心肌中表达水平有差异的miRNA。原代分离法获得C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞(mCF),建立AngⅡ处理mCF的心肌纤维化细胞模型。mCF转染miR-25-3p mimic后检测纤维化相关基因的表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-25-3p与B细胞易位基因2(BTG2)的3′端非翻译区(3′UTR)的结合作用。放线菌素D实验验证BTG2对超氧化物歧化酶2(SOD2)稳定性的作用。结果 miR-25-3p在AngⅡ灌注诱导的小鼠心肌和AngⅡ处理的mCF中表达升高。转染miR-25-3p mimic可使mCF中的Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、Ⅲ型胶原α1(COL3A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达显著增加。双荧光素酶报告基因实验和功能实验证实BTG2是miR-25-3p的下游靶基因,并参与介导miR-25-3p促进mCF中纤维化相关基因表达的作用。机制研究证实BTG2可通过增加SOD2 mRNA的稳定性而上调其表达。结论 miR-25-3p通过抑制BTG2的表达来下调SOD2的水平进而增强纤维化相关基因的表达,发挥促进心肌纤维化的作用。     

主动脉夹层与肌球蛋白重链11基因多态性的关系

目的:探讨肌球蛋白重链11(MYH11)基因多态性与主动脉夹层发病的关系。方法:从主动脉夹层患者(107例)及对照组(110例)外周血单核细胞提取基因组DNA,并利用已发表的文献资料以及最小等位基因频率(MAF≥10%)对MYH11的SNPs进行了选择。最后通过基于单碱基引物延伸原理的Multiplex SNaPshot SNP分型技术对所有的DNA样本进行SNPs基因型检测。结果:主动脉夹层患者中,MYH11基因rs1050111等位基因频率(12.4%)显著低于对照组(23.8%,P<0.05),两组之间其余3个位点(rs1050113、rs1050162 rs880071)的基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MYH11基因rs1050111多态性与中国汉族人群主动脉夹层的发病可能相关,CC基因型可能是主动脉夹层的遗传易感因素之一。     

肝螺杆菌脂多糖提取及纯化方法的建立

目的 建立肝螺杆菌脂多糖(LPS)提取与纯化方法.方法 采用脂多糖提取试剂盒提取肝螺杆菌LPS,并用DNase I和RNase酶除去DNA和RNA,纯化LPS.三次测定LPS中糖、蛋白质及核酸的含量,并用SDS-PAGE电泳银染方法分析LPS纯度.结果 肝螺杆菌为形态细小、Giemsa's染色阴性的不规则螺旋型杆菌.纯化的LPS平均产率为0.202％,平均蛋白质含量为0.365 g/L,平均核酸含量为0.413 mg/L,三者结果的稳定性好,批间比较差异无统计学意义(P＞0.05).SDS-PAGE电泳结果显示,LPS提取物与标准品比较,主要条带清晰,位置相同.结论 建立了一种有效提取肝螺杆菌LPS的方法,该方法简便可行、提取物纯度高,核酸及蛋白质含量低,值得推广应用.     

建立缝隙连接蛋白43基因定点突变细胞株的研究

目的定点突变是通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的 DNA片段中引入包括碱基的添加、删除、点突变等所需变化。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段。连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心脏表达最丰富的连接蛋白,主要分布在心室,其构成的缝隙连接(gapjunction,GJ)在心肌细胞中的电偶联中起着非常重要的作用。近年来的研究表明干细胞移植治疗心肌梗死时,细胞间电偶联障碍是导致心律失常副作用的一个重要原因。己知Cx43的磷酸化状态可以调节通道的功能,磷酸化常见的是368位点的丝氨酸磷酸化。我们对缝隙连接蛋白43基因(Cx43)的特定碱基进行定点改变,从而改变对应的氨基酸序列,并对表达产物进行研究,以利于将来探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染突变的Cx43对其向心肌分化能力的影响,及其磷酸化状态是否对心律失常有调控作用。方法设计引物,sense:5’-CTTCAAGCAGAGCCAGCAGTCGTGCCAGCA-3’,antisense:5’TGCTGGCACGACGACTGCTGGCTCTGCTTGAAG-3’。以已构建的Pcdh-Cx43为模板,使用Stratagene基因定点突变试剂盒进行PCR扩增,用DpnI酶识别甲基化位点并将其酶切,PCR产物转化后筛选阳性克隆,提取质粒测序验证。在293FT中与其它3个穿梭质粒一起包装,再将慢病毒颗粒转染BMSCs,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆BMSCs-mCx43,在压力培养基下传代培养。用流式细胞仪检测BMSCs-mCx43的干细胞相关表面标记表达情况,同时用western blot检测BMSCs-mCx43的蛋白表达情况。结果测序结果显示突变位点正确,荧光照片显示90%的293FT表达绿色荧光。50%的BMSCs有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞仪检测示BMSCs-mCx43细胞CD29阳性表达94%±0.8%,CD73阳性表达92%±0.7%,几乎不表达CD34和CD105,与未转染病毒的BMSCs和转染空病毒载体的BMSCs的表面标记一致。Western blot结果     

利用酵母双杂交系统鉴定MIF与CD74胞外片段间的相互作用

目的利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）与Ⅱ型穿膜蛋白CD74胞外片段间可能的相互作用区域。方法利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的人全长MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115的重组诱饵质粒,以pGADT7为载体的人CD7473-232、CD7473-109、CD74109-149、CD74149-232的重组激活域（AD）质粒。用PEG/LiAC法将上述重组诱饵质粒分别与重组AD质粒两两共转化感受态酵母菌AH109,分别观察在SD/-Trp-Leu、含X-α-gal的SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长情况。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实所构建的重组质粒全部正确。3种重组诱饵质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-trp上生长,4种重组AD质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-leu上生长,而且上述转化的酵母菌AH109均无自身转录激活活性。只有MIF、MIF50-65、MIF1-50/65-115与CD7473-232表达质粒共转化的酵母菌AH109可在SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长,能激活MEL1报告基因,使X-α-gal变蓝。结论MIF能以功能域MIF50-65非依赖性方式与完整的CD74胞外片段相互结合,进行细胞信号转导。