刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究北大核心CSCD

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

灭螺鱼安杀灭华支睾吸虫第一中间宿主螺类的研究

华支睾吸虫病在我国流行甚广,迄今有关流行病学及治疗等方面报道颇多,但对其中间宿主的防治未见有报道。作者为寻求华支睾吸虫病新的防治对策,于1986年采用湖北制药厂生产的灭螺鱼安首次在室内与现场进行杀灭华支睾吸虫宿主纹沼螺和长角涵螺等试验观察,取得了较满意的效果。     

微小隐孢子虫重组BCG-CP15／60-23疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗。方法以pET-30a-CP15／60-23质粒为模板，PCR扩增CP15／60—23基因片段，然后克隆至TA载体；通过酶切、测序鉴定后，将CP15／60—23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白（HSP）启动子下游，构建重组质粒pMV262-CP15／60—23，用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗（BCG—WT）构建微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗。结果扩增出792bp的微小隐孢子虫CP15／60—23基因片段，成功构建pMV262-CP15／60—23质粒，并通过PCR扩增和提取质粒、酶切等表明该质粒被正确导入BCG—WT中。结论成功构建微小隐孢子虫CP15／60—23基因重组卡介苗，为研究隐孢子虫病新的防治方法打下了基础。     

山东省人体肠道寄生虫虫种与分布调查

根据卫生部下达的《全国人体寄生虫分布调查计划》要求,我们于1988～1990年,对全省人体肠道寄生虫虫种与分布情况进行了调查,结果如下。一、材料与方法 (一)调查目标包括肠道寄生虫的各种原虫、线虫、吸虫和绦虫。 (二)调查方法 1.粪便检查:按《全国人体寄生虫分布调查实施细则》中的方法进行。 2.透明胶纸肛周拭擦法:检查蛲虫卵。     

弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制

目的 研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果 以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义（P〈0.001）;实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论 该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。     

抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用

目的制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体（McAb），为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定McAb亚类和效价；通过SDS—PAGE和Western blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目；利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点。结果筛选出3株（4810、283、1H6）特异性较好的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示，283、1H6产生的MeAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30kDa处，4810反应带主要在22kDa处；283，1H6，4810MeAb的效价（ELISA）分别为：1：102400、1：51200、1：12800；283、1H6为IgM，4810为IgG2b；3株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀，表面出现缺口和空洞，虫体变形破碎、膜变厚。抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a—ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白。结论抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用，能准确识别P30抗原，可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制。     

脑囊虫病人血清特异IgG4测定

应用ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ检测脑囊虫病人血清特异性ＩｇＧ４抗体,检出率为９３．８３％（１５２／１６２）,ＧＭＲＴ为１：１４２４。其中重度囊虫感染病人的特异ＩｇＧ４检出率为１００％（２９／２９）,ＧＭＲＴ为１：２０９５;中度感染病人为９５．４５％（６３／６６）,ＧＭＲＴ为１：１５１０;轻度感染病人为８９．５５％（６０／６７）;ＧＭＲＴ为１：４００。显示血清特异ＩｇＧ４检出率降为３８．４６％（１０／２６     

膳食结构对鞭虫感染人群肠道菌群的影响研究

目的 探讨不同膳食结构对鞭虫感染人群肠道菌群的影响，为研究鞭虫感染者肠道疾病与饮食关系奠定基础。方法 在山东省日照市岚山区5个乡镇选取34名鞭虫感染者，收集研究对象膳食资料，通过16S rDNA测序平台分析不同膳食结构下鞭虫感染人群肠道菌群多样性和物种组成的差异。结果 未发现膳食摄入量高低与肠道菌群α多样性或β多样性有关，但蔬菜、奶制品和肉制品三种膳食结构与鞭虫感染人群肠道菌群的丰度与组成有显著关联。不同蔬菜摄入量组在属水平上相对丰度变化差异有统计学意义的有3个菌属：每日摄入量<300 g的鞭虫感染组（PDV3组）狭义梭菌属1（Clostridium sensu stricto 1）相对丰度高于每日摄入量>500 g的鞭虫感染组（PDV1组）（t=2.211，P<0.05）；PDV3组瘤胃球菌属（Ruminococcus）相对丰度低于PDV1组（t=2.246，P<0.05）；PDV3组双歧杆菌属（Bifidobacterium）相对丰度低于每日摄入量300~500 g的鞭虫感染组（PDV2组）（t=2.610，P<0.05）。不同奶制品摄入量组在属水平上相对丰度变化差异有统计学意义的有3个菌属：每日摄入量300~500 g的鞭虫感染组（PDD2组）狭义梭菌属1相对丰度高于每日摄入量>500 g的鞭虫感染组（PDD1组）（t=3.025，P<0.05）；每日摄入量<300 g的鞭虫感染组（PDD3组）另枝菌属（Alistipes）相对丰度低于PDD1组（t=3.234，P<0.05）；PDD3组瘤胃球菌UCG-014属（Ruminococcaceae UCG-014）相对丰度低于PDD2组（t=2.255，P<0.05）。不同肉制品摄入量组在属水平上相对丰度变化差异有统计学意义的有3个菌属：每日摄入量120~200 g的鞭虫感染组（PDM2组）考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和瘤胃球菌属2（Ruminococcus 2）相对丰度低于PDM1组（t=2.672、2.731，P均<0.05）；每日摄入量<120 g的鞭虫感染组（PDM3组）小类杆菌属（Dialister）相对丰度低于PDM2组（t=2.402，P<0.05）。结论 不同膳食结构影响鞭虫感染人群的肠道菌群组成，提示应重视日常膳食摄入对鞭虫感染人群肠道疾病的调节作用，通过补充蔬菜、奶制品、肉制品来降低狭义梭菌属1等有害菌丰度，提高双歧杆菌属和另枝菌属等有益菌丰度，提高机体免疫力，减轻或避免鞭虫感染人群肠道炎症性疾病的发生发展。