SELDI—TOF MS室内质量控制的初步研究

目的:表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)是快速、高通量的蛋白质组学分析技术.像所有技术一样,质量控制是SELDI-TOF MS应用于临床的关键.本文就SELDI-TDF MS室内质量控制进行初步研究.方法:收集本院门诊患者血清,对仪器进行内标、外标校准后,采用Biomarker Wizard软件对同一血清样本在不同批次的芯片进行比较.结果:质量CV值小于0.1%,而血清样本的峰值的平均CV值也都控制在30%以内,质控血清也相当稳定.结论:初步建立了SELDI-TOF MS的质控方案.     

舍格伦综合征A抗原（SSA60）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及胶体金快速检测方法的建立

目的 在巴斯德毕赤酵母中表达舍格伦综舍征A抗原(SSA60)并建立肢体金快速检测方法.方法 表达质粒pPIC9k-SSA60用电穿孔法转化酵母菌SMDI168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和斑点免疫金渗滤法(DIGFA)鉴定.结果 表达产物SSA60的分子量约60 000,高拷贝巴斯德毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60%以上,产物浓度为600～950 mg/L.DIGFA检测85份舍格伦综合征(SS)患者血清和30份正常人血清,抗SSA检测阳性率为95.3%(81/85),特异度为100%(30/30).与德国欧蒙ENA酶斑点法对比检测的符合率为96.5%(111/115),差异无统计学意义(P>0.05).结论 SSA60在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,DIGFA简便、快速、准确,可用于临床自身免疫病的诊断.     

利用毕赤酵母菌SMD1168表达SSA重组抗原

目的利用电穿孔法将pPIC9k-SSA重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获得SSA重组抗原。方法以人白血病淋巴细胞HL-60株为模板扩增SSA基因,将其转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-SSA重组质粒,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获取目的蛋白。结果成功构建pPIC9k-SSA重组质粒并导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中,获得稳定整合目的基因的菌株;重组菌株经诱导表达出产物相对分子量约为50kDa的SSA蛋白,具有抗原性可与SSA抗体特异性结合。结论本实验室通过分子克隆技术,从毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中获得了人SSA抗原,为今后建立斑点免疫金渗滤法(DIGFA)法检测抗SSA抗体奠定基础。     

IRIS iQ200全自动尿沉渣分析仪与Sysmex UF-100分析仪及人工镜检的比较和评价

尿沉渣中有形成分检查经典的方法是在显微镜下进行人工判别.人工镜检最大的问题是速度慢,在当前临床检查的标本不断增加的大医院,每份尿都进行人工镜检难以做到.20世纪80年代,美国IRIS公司推出的Yellow IRIS全自动尿沉渣分析仪采用流式细胞仪的进样技术和电脑控制的自动识别尿中有形成分的“自动智能显微镜”（automated intelligence microscopy AIM） ,对流动视野中的有形成分进行摄影、判别和分析,并定量报告,使尿沉渣检测自动化、标准化和便捷化.该仪器一经推出,就受到广泛的好评.2002年,美国IRIS公司在YELLOW IRIS基本原理基础上,推出了iQ200全自动尿沉渣分析仪,我们通过与其他方法进行对比观察,对该仪器的性能特点作初步分析.     

抗SSA／Ro抗体研究的新进展

1979年Alspaugh等使用培养人淋巴细胞提取物与原发性Sjogren＇s综合征（pSS）患者的血清进行研究。发现该提取物中含有两种新的自身核抗原即SSA和SSB抗原，1979年Alspaugh与Clark又证明SSA抗原与Clark1968年发现的Ro抗原是同一种物质。故命名为SSA／Ro抗原，针对SSA／Ro抗原的自身抗体是已知的核糖核蛋白（fibonudeopro-teincomplex，RNP）抗体中分布最广、最常见的自身抗体之一。     

人自身抗原Sm B'基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原Sm B'.方法 PCR扩增Sm B'基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Sm B'.用电穿孔法转化酵母菌Sm D1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(WB)鉴定,并用免疫酶斑点法和免疫印迹法(immunoblot,IBT)检测与评价分析30例系统性红斑狼疮(SLE)患者、30例混合结缔组织病患者和30名健康体检者血清中抗-Sm B'水平差异.结果 PCR产物约700 bp,与预期657 bp接近,pPIC9k-Sm B'重组阳性克隆测序结果与核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Sm B'的相对分子质量约32 000,WB法证实表达产物具有天然Sm B'分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的 表达条带.免疫酶斑点法检测阳性率为46.7%(42/90),IBT的检测阳性率为51.1%(46/90);2种方法检测结果一致性较佳(Kappa值=0.911 2,P<0.01).结论 Sm B'在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,这为Sm B'试剂盒研究奠定了基础.     

适体在病原生物感染诊断和治疗中的应用

适体是通过指数富集配基的系统进化技术获得的,能与靶物特异、高亲和力结合的单链DNA或RNA序列。随着越来越多与毒素、蛋白质、微生物等靶物质特异性结合适体的筛选,适体作为抗体的替代品在疾病的诊断和治疗领域已显示了巨大的潜能。现简要综述国内外应用适体技术诊断和治疗病原生物感染的新进展。     

肺癌组织DcR3基因表达与临床TNM分期的关系

目的 研究DcR3基因在原发性肺癌组织中扩增和表达情况,探讨该基因在原发性肺癌中过度表达的临床意义.方法 利用免疫组织化学法检测26例肺癌组织和21例肺部良性病变组织DcR3蛋白的原位表达;荧光定量PCR法检测26例肺癌组织中DcR3基因的扩增倍数.结果 免疫组织化学显示肺癌组织存在DcR3表达,并且呈现肿瘤特异性.部分肺癌组织出现细胞浆和细胞核DcR3表达,以细胞核内表达为主.仅4.8%的肺部良性病变组织存在DcR3表达.38.5%的肺癌组织中DcR3基因扩增倍数超过2,平均扩增倍数为1.87±1.25.结论 DcR3在肺癌组织中存在细胞浆表达和细胞浆胞核均表达,以细胞核内为主的两种现象.原发性肺癌患者存在DcR3基因的扩增和过度表达,DcR3表达水平随着肺癌TNM临床分期的增加而增高.     

适体在病原体感染中应用研究进展

Aptamers一词源于拉丁文Aptus,意即适合,故译为适体,由Ellingtin等于1990年首次提出~[1],是体外人工合成具有确定二级或三级结构的单链DNA或RNA寡核苷酸分子.通过指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)可从随机寡核苷酸库中筛选出针对任何靶分子的适体.     

靶向DcR3的siRNA抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的实验研究

目的以脂质体为载体,探讨靶向诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)的siRNA对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法裸鼠背部皮下种植结肠癌SW480细胞,建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型。针对靶标DcR3基因,利用Dharmacon公司软件设计并合成siRNA序列,通过瘤体局部多点注射脂质体与DcR3 siRNA混合物,将DcR3 siRNA转染到裸鼠背部皮下移植瘤内。同时设立阴性对照组和空白对照组。观察肿瘤治疗前后体积变化,评价DcR3 siRNA对肿瘤的抑制作用;比较肿瘤治疗前后的细胞形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测DcR3基因表达;原位细胞凋亡检测肿瘤的凋亡情况。结果治疗组肿瘤体积明显小于对照组,肿瘤组织内坏死面积增大,细胞凋亡率显著增高,DcR3蛋白表达水平降低。治疗过程中裸鼠生长良好,无明显毒性反应。结论脂质体介导的DcR3 siRNA对裸鼠皮下结肠癌SW480细胞移植瘤有明显抑制、杀伤作用,细胞凋亡是DcR3 siRNA所致肿瘤细胞死亡的重要形式。