分枝杆菌噬菌体DNAⅢ生物学特性及其抗耐药结核潜力

【摘要】 目的 研究分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的生物学特性及抗耐结核潜力，筛选鸡尾酒疗法配方噬菌体。方法 采用双层琼脂培养法制备噬菌体DNAⅢ，观察噬菌斑特点；透射电镜观察DNAⅢ形态；噬菌斑实验检测DNAⅢ最佳和最小感染复数(MOI)；通过一步生长曲线实验确定DNAⅢ潜伏期及裂解量；检测DNAⅢ对温度、酸碱度的耐受情况；检测DNAⅢ对分枝杆菌的裂解谱；血清中和实验检测DNAⅢ的抗原性，及其与其它8种分枝杆菌噬菌体之间的亲缘关系。结果 DNAⅢ噬菌斑圆形透明，直径约1mm；DNAⅢ尾长（208±287） nm；最佳MOI为10-4，DNAⅢ对耻垢分枝杆菌极度易感；DNAⅢ感染宿主菌的潜伏期约为165min，裂解量为28；DNAⅢ对热、酸碱均敏感；DNAⅢ能裂解耻垢分枝杆菌、结核分支杆菌标准株、多数结核分枝杆菌临床耐药株；DNAⅢ K值为77001，抗血清对非对应噬菌体的中和活性差。结论 DNAⅢ抗原性低，裂解谱广，具有抗耐药结核作用，可作为鸡尾酒疗法的候选噬菌体。     

集中护理模式对于提高COPD患者吸入制剂使用正确率、肺功能和减少再入院风险的价值

目的探究慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary,COPD)患者应用集中护理模式对于吸入制剂使用、肺功能和再入院的影响。方法选择2016年1月至2016年4月来四川省成都市第三人民医院就诊的COPD患者102例,随机数字表法分为对照组和实验组,每组51例,在常规治疗的基础上,对照组和对照组分别给予常规护理与集中护理模式,院外随访12个月。比较2组比较护理前后的吸入制剂使用评分和正确率、治疗依从性(MASES评分)、肺功能指标、症状评分(mMRC评分)、活动能力(6MWT)和生活质量(SGRQ评分),绘制生存曲线,比较2组患者AECOPD和再入院的发生风险。结果与护理前相比,2组患者的吸入剂使用评分和正确率以及MASES评分均明显升高(P <0.05),其中,实验组的吸入剂使用评分和正确率以及MASES评分均显著高于对照组(t/χ~2=3.977, 14.294,6.307, P=0.000,0.000,0.000)。护理后2组的FEV1%Pred和FVC%Pred均明显高于护理前(P <0.05),对照组护理后的TLC和RV/TLC明显升... 更多     

分枝杆菌噬菌体Leo的生物学和基因组学特征

目的 筛选能有效裂解结核分枝杆菌的噬菌体,并了解其生物学和遗传学信息.方法 双层平板法扩增噬菌体,观察噬菌斑形态;电镜观察噬菌体颗粒形态;单斑法检测噬菌体宿主谱.采用λ噬菌体提取试剂盒提取噬菌体DNA,鸟枪法测序,得到的DNA序列用Phred/PhraD/Consedh软件包组装,拼接重叠群,PCR扩增重叠群缺口.采用DNAStar软件包、Glimmer3.0基因预测软件、Promoter prediction/Prokaryotic程序进行基因成分分析,基因功能预测,启动子区预测,并同时对Leo作共线性分析及构建系统进化树.结果 噬菌体Leo由多面体头部和尾部构成,头部直径(70.0±3.0)nm,尾长(211.0±31.7)nm.其噬菌斑清晰透明,能裂解不同的结核分枝杆菌临床分离株.Leo基因组全长39 981 bp,GC含量66.86％,含3个可能的启动子区,不含串联重复序列和tRNA区.Leo含59个基因,gene32编码整合酶,不含编码阻遏蛋白的基因和不利基因,Leo与BPs和Angel相似性最高.结论 噬菌体Leo是一株不含不利基因的裂解性噬菌体,能裂解结核分枝杆菌,可以作为鸡尾酒疗法的候选噬菌体.     

噬菌体Chy5的生物学和基因组学特征

目的 筛选能感染结核分枝杆菌的溶源性噬菌体,了解其生物学及遗传学信息。方法 从土壤中分离纯化噬菌体;电镜观察噬菌体形态;单斑法测定宿主谱;提取噬菌体DNA,鸟枪法随机测序。采用DNAStar软件包分析基因组成分,Glimmer3.0、GeneMark软件预测基因功能,同时做共线性分析。分离溶源菌,通过紫外线诱导试验、超免反应验证噬菌体溶源性。结果 分离到一株新的噬菌体Chy5,其头部直径(61.5±1.4) nm,尾部长度(114.1±2.1) nm,为长尾噬菌体,可感染敏感及耐药结核菌株。Chy5基因组全长51 214 bp,G+C含量63.60%,与噬菌体D29基因组最相似,有88个推定基因,含有编码整合酶和阻遏蛋白的基因以及attP位点。经紫外线诱导Chy5溶源菌可形成噬菌斑,Chy5与其溶源菌共培养会发生超免反应。结论 分离到一株新的能感染敏感及耐药结核菌的溶源性噬菌体Chy5,其基因组与噬菌体D29相似,有望应用于构建荧光报告噬菌体。     

微信平台下的CBL教学法应用于呼吸科临床教学的效果研究

目的:研究微信平台下的CBL教学法应用于呼吸科临床教学的效果。方法:随机将我院呼吸科2018年1月至2019年6月参与临床教学的72名护理实习生平均分为两组,对照组采取传统教学方法,观察组基于微信平台采取CBL教学法,比较两组实习生的临床教学效果。结果:观察组出科时理论及实践考核成绩较入科时及对照组明显提高(P<0.05),且认可临床教学的实习生占比显著高于对照组(P<0.05)。结论:呼吸科基于微信平台采取CBL教学法进行临床教学可取得理想效果。     

老年人慢性阻塞性肺疾病急性加重期并发呼吸衰竭和多器官功能障碍综合征凝血功能的变化及其临床意义

目的：探讨分析老年人慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)并发呼吸衰竭(respiratory failure,RF)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)凝血功能的变化及其临床意义。方法选择2014年3月至2015年6月老年人单纯 AECOPD 患者30例(AECOPD 组),AECOPD 并发 RF 患者26例(RF 组),AECOPD 并发 MODS 患者19例(MODS 组),同时选取同期我院体检的健康老年人30名(对照组),比较各组的血小板、D-二聚体、纤维蛋白原、活化的部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间、氧分压、二氧化碳分压等肺功能指标差异。结果对照组、AECOPD 组、RF 组、MODS组患者的 D-二聚体、纤维蛋白指标依次上升,差异有统计学意义(P <0.05);对照组、AECOPD组、RF 组、MODS 组患者的氧分压、二氧化碳分压等肺功能指标组间差异有统计学意义(P <0.05);而血小板、活化的部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间指标在对照组、AECOPD 组、RF组、MODS 组患者中呈上升趋势,但差异无统计学意义(P >0.05)。结论老年人 AECOPD 患者处于高凝状态,当合并 RF 和 MODS 时血凝状态加重,值得临床及早重视并采取相关措施以防止病情加剧、恶化。     

下调DC-SIGN-ManLAM结合信号恢复树突状细胞活化初始T细胞的能力

目的 探讨利用RNAi下调DC-SIGN与ManLAM结合信号对树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化初始T细胞能力的影响.方法 利用筛选出的人DC-SIGN分子RNAi有效靶点,构建并包装产生慢病毒表达载体.实验分为:干扰组、空载体组和空白对照组.利用慢病毒表达载体下调DCs表面DC-SIGN分子水平,流式细胞仪、RT-PCR及Western blot检测各组DCs DC-SIGN分子水平变化,在LPS存在下,与ManLAM共培养18 h后,流式细胞仪检测DCs表面成熟标志物,ELISA方法检测DCs 刺激CD4+CD45RA+初始T细胞向Th1分化能力,以了解下调DC-SIGN与ManLAM结合信号对DCs活化初始T细胞的能力的影响.结果 ①包装慢病毒产生浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/ml.②流式细胞仪检测干扰组DCs表面DC-SIGN分子表达水平较其余2组显著降低(F=14.19,P<0.05),RT-PCR检测干扰组DC-SIGN目的条带灰度值/内参灰度值(0.252 5±0.139 6)与空白对照组(0.572 2±0.190 9)及空载体组(0.548 7±0.119 3)相比灰度值显著下降 (F=8.142,P<0.05),Western blot检测干扰组DCs内DC-SIGN蛋白水平均显著低于空载体组和空白对照组(F=51.376,P<0.05).③干扰组DCs的成熟标志物CD86(F=15.59,P=0.004)、CD83(F=18.03,P=0.003)、HLA-DR(F=7.684,P=0.022)水平较空载体组和空白对照组明显增高.④DCs与初始T细胞共培养,干扰组分泌IFN-γ(F=18.434,P=0.003)、IL-2(F=31.08,P=0.001)水平较空载体组和空白对照组显著增高.结论 利用RNAi慢病毒载体下调DCs表面DC-SIGN水平,减弱DC-SIGN与ManLAM结合信号,能够恢复DCs的成熟受阻,最终使得DCs活化初始T细胞的能力恢复.     

ManLAM对树突状细胞成熟及下游免疫的影响

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)成分带甘露聚糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan,ManLAM)对树突状细胞(dendriticcells,DCs)成熟及下游免疫的影响。方法:分离健康人外周血单个核细胞,用GM-CSF和IL-4诱导DCs生长,培养至第五天换液加细胞因子,第六天分三组,按实验设计加ManLAM和LPS。第七天收集细胞送流式检测DC-SIGN、HLA-DR、CD86、CD83表达水平;ELISA检测DCs培养上清液中IL-12和IL-10水平;混合淋巴细胞反应检测DCs诱导CD4+T淋巴细胞增值能力;DCs与初始CD4+CD45RA+T细胞共培养48小时后,ELISA检测培养上清液中IFN-γ水平。结果:(1)ManLAM组DCs表达CD86、CD83等成熟标志物较成熟DCs组下降,差异有统计学意义(P0.05);(2)ManLAM组DCs培养上清液中IL-10水平较成熟组升高,IL-12水平较成熟组下降,差异有统计学意义(P0.05);ManLAM组DCs刺激淋巴细胞增殖能力及刺激初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力较成熟组下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ManLAM干扰DCs成熟,下调DCs诱导的淋巴细胞增殖能力和激活初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力。     

噬菌体疗法治疗大肠埃希菌感染的研究现状及应用前景

大肠埃希菌(Escherichia coli)是医院获得性感染常见致病菌,在临床分离的致病菌中仅次于铜绿假单胞菌,排在第2位,主要引起呼吸道、泌尿道、伤口、胆道感染,腹膜炎、败血症及脑膜炎等。近年来细菌流行病学监测结果表明,大肠埃希菌耐药率逐年上升,已成为临床治疗面临的一大难题[1]。噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒的总称,分布极广,凡是有细菌的场     

噬菌体Legendre的生物学特性及抗耐药结核潜力的初步研究

目的研究噬菌体Legendre的生物学特性并初步探索其用于抗耐药结核的潜力。方法双层平板法制备Legendre的噬菌斑,观察其特点,纯化噬菌体,电镜观察Legendre形态;提取Legendre基因组,限制性内切酶酶切分析确定其核酸类型;以不同感染复数扩增Legendre,找出最佳MOI和最小MOI;通过一步生长实验找出Legendre潜伏期、裂解期和裂解量;纯化Legendre颗粒,免疫家兔,获得抗血清,通过中和反应实验测定Legendre以及其他8种噬菌体和Legendre抗血清之间的吸附反应常数K值;采用单斑法测定Legendre的宿主谱;检测Legendre对紫外线、温度、氯仿、酒精、酸碱度的耐受性。结果 Legendre的噬菌斑圆形透明,边界清楚,Legendre头部呈多面体立体对称,直径平均为65 nm,尾长平均为215 nm;基因组核酸能被双链DNA内切酶EcoRⅠ,HindⅢ及BamHⅠ切开,大小约65 kb;Legendre最佳MOI为10-4,最小MOI为10-3,Legendre对耻垢分枝杆菌极度易感;Legendre感染宿主菌的潜伏期为180 min,裂解期为120 min,裂解量为13;Legendre K值为697,Legendre抗血清对非对应噬菌体的中和活性有差异,对DNAⅢ、Bo4、Clark、Sedge、Leo高,对TM4、D29中和活性较低;Legendre能裂解耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株、多数临床耐药株;Legendre对紫外线、温度、氯仿、酒精、酸碱度均敏感。结论 Legendre属于长尾噬菌体科,双链DNA噬菌体,抗原性低,宿主谱广,具有抗耐药结核潜力。