未知cDNA扩增与亚克隆的方法学研究

新型蛋白质的分子克隆基本依靠ｃＤＮＡ文库的筛选，而文库构建的载体多为λｇｔｌｌ。由于λｇｔｌｌＤＮＡ分子量较大（４９ｋｂ），提取过程中多用ＰＥＧ，因此λｇｔｌｌｃＤＮＡ克隆及其直接序列测定极为困难。为克服此困难，作者自行设计了不含克隆位点的一对公用λｇｔｌｌＰＣＲ引物。试用表明，此引物通过改变ＰＣＲ反应条件，可特异性地扩增多种彼此独立的ｃＤＮＡ。经亚克隆后的序列测定表明，用此方法扩增克隆的多种ｃＤＮＡ保留了原有阅读框架和ｐｏｌｙＡ特有序列，因而基本解决了新型蛋白质分子克隆中ｃＤＮＡ亚克隆与序列测定的困难．     

尿激酶氨基末端基因抗乳腺癌细胞转移的实验研究

目的：探讨尿激酶氨基末端（ATF）基因转移对肿瘤转移的抑制作用。方法：构建重组ATF基因真核表达载体pcDNA3-ATF,用脂质体Lipofectin介导,将其导入其证明尿激酶（uPA)和尿激酶受体（uPAR）均有表达的人乳腺癌细胞系MCF－7,用Western blot检测转染细胞ATF基因的表达,体外观察并比较了野生型和转基因MCF－7细胞侵袭人工基底膜能力;裸鼠皮下接种癌细胞,复制自发性肿瘤转移模型,观察成瘤性和转移性。结果uPA／uPAR在MCF－7中有较高水平的表达;转ATF基因后,可检测到ATF的明显表达,体外侵袭穿透人工基底膜的能力明显降低,体内原位成瘤性不受影响,但自主性体肺转移能力有一定程度的下降,结论ATF基因转移后,ATF的表达可能竞争 抑制内源性uPA与uPAR的结合,在一定程度上抑制癌细胞的侵袭和转移。