表面增强拉曼光谱技术检测隐球菌脑膜炎患者血清中CD93~+外泌体及其意义

目的利用表面增强拉曼光谱技术(SERS)检测隐球菌脑膜炎患者血清中CD93~+外泌体,以优化该病的监测手段。方法收集2013年12月~2017年3月在上海长海医院和长征医院确诊的38例隐球菌脑膜炎患者的血清作为实验组,同期体检的38例健康者血清作为对照组。用ELISA法检测血清中的IFN-γ,TNF-α的蛋白表达水平;用超高速离心法分离血清外泌体;用磁珠连接抗体法捕获CD93~+外泌体并进行标记,于拉曼光谱仪下检测样本的SERS信号。实验组与对照组计量资料间的比较采用两独立样本的t检验,用Origin75软件对两连续变量进行线性拟合,两变量之间的相关性以Pearson系数表示。结果 SERS检测隐球菌脑膜炎患者血清中外泌体最低浓度为5 500个/ml,最低量为110个/ml,log(SERS信号)与log(外泌体浓度)进行线性拟合的R值为0.995 96,P0.0001;SERS检测实验组与对照组血清外泌体CD93的信号值取对数分别为2.75±0.59vs 2.47±0.15,差异具有统计学意义(t=2.835,P=0.005 9);SERS检测实验组血清CD93~+外泌体得到的数据与ELISA法检测实验组血清中IFN-γ,TNF-α的结果呈正相关,差异有统计学意义(r=0.389,0.478,P0.05)。结论该方法可初步提高隐球菌脑膜炎患者血清标本检测的灵敏度,为该病监测提供新的技术思路。     

抗Granulysin多克隆抗体的制备及鉴定

目的构建人颗粒溶素(granulysin,GNLY)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到9kD目的蛋白片段,免疫新西兰大白兔制备兔抗颗粒溶素多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法获得编码人颗粒溶素的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-28a(+),构建pET28a(+)-GNLY表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人颗粒溶素血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果6×His融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6000。结论获得了纯化的颗粒溶素9kD蛋白和anti-GNLY多抗血清,为今后对疾病中CTL和NK细胞活性的研究打下了基础。     

原发性舍格伦综合征患者外周血单个核细胞中TIM-3表达增高及意义

目的：探讨T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）在原发性舍格伦综合征（pSS）发病机制中的作用。方法收集2012年10月～2013年7月期间上海长征医院和长海医院门诊及住院 pSS患者33例,同期纳入健康对照者33例。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测33例 pSS患者及33例健康对照组外周血单个核细胞（PBMCs）中TIM-3的相对表达量,并分析TIM-3与 pSS患者特征性实验室指标（血清 RF,CRP,抗 SSA和抗 SSB抗体）的相关性;对12名接受2个月糖皮质激素治疗的患者进行随访,分析TIM-3 mRNA在 pSS患者治疗前后的表达变化情况。结果pSS患者外周血 PBMCs 中 TIM-3 mRNA 的表达较健康对照组显著升高（0.55±0.12 vs 0.13±0.10,t＝15.44,P＜0.0001）,但在抗 SSA和抗 SSB抗体阳性和阴性患者之间,TIM-3水平差异无统计学意义（0.45±0.21 vs 0.54±0.31;0.46±0.15 vs 0.51±0.24;P值均＞0.05）。进一步分析发现,pSS患者外周血 PBMCs 中 TIM-3 mRNA的表达与血清RF,CRP水平呈正相关（R＝0.5585,0.4147;P值均＜0.05）;12名 pSS患者经过糖皮质激素治疗后,TIM-3的表达较治疗前下降（0.62±0.10 vs 0.38±0.13,t＝5.07,P＜0.05）。结论 TIM-3可能参与了pSS的发病机制,是pSS潜在的标志物。     

原发性干燥综合征患者单核源性树突状细胞对聚肌苷酸胞苷酸刺激的反应性

目的观察原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单核源性树突状细胞在聚肌苷酸胞苷酸(polyI∶C)刺激下释放干扰素等炎性因子的能力。方法用白细胞介素(IL)-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子从pSS患者外周血单核细胞中诱导出树突状细胞,并用50μg/mL polyI∶C进行刺激,在刺激后第6、12、24小时以ELISA法检测细胞培养基上清液中干扰素(IFN)-α、IFN-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-23的浓度,以RT-PCR检测树突状细胞内Toll样受体3(TLR3)分子的表达。结果在polyI∶C作用下,pSS患者单核源性树突状细胞释放IFN-α、IFN-β及TNF-α等因子的能力显著强于来自健康个体的单核源性树突状细胞。虽然pSS患者及健康个体单核源性树突状细胞内TLR3的表达在polyI∶C刺激作用下均随时间逐渐降低,但pSS患者TLR3的降低相对缓慢。结论 pSS患者单核源性树突状细胞对polyI∶C刺激呈现高反应性,且这种高反应性可能与TLR3信号作用异常有关。单核源性树突状细胞的这种特征可能与pSS的发病机制有关。     

免疫性血小板减少性紫癜患者单个核细胞中microRNA-30a表达增高及其意义

目的 探讨microRNA-30a是否参与了免疫性血小板减少性紫癜（ITP）的发病机制.方法 采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）技术检测38例ITP患者及35例健康者外周血单个核细胞（PBMC）中microRNA-30a和Lyn mRNA的相对表达量,并进行统计分析.结果 ITP患者外周血PBMC中microRNA-30a表达较健康对照组明显增高（P〈0.01）,且与血小板计数呈负相关（r2=0.42,P〈0.05）;ITP患者外周血PBMC中Lyn mRNA表达较健康对照组明显降低（P〈0.01）,且与microRNA-30a呈负相关（r2=0.33,P〈0.01）.结论 microRNA-30a可能通过Lyn参与了ITP的发病机制.     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中Tim-1表达增高及其意义

目的 检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血Tim-1,IFN-γ和IL-4的表达水平,分析其相关性,初步探讨Tim-1在PBC诊治中的临床意义。方法 收集2013年6月～2015年11月来长海医院就诊的32例PBC患者和32例同期就诊的健康成人的外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)法检测PBMC中Tim-1 mRNA,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆中Tim-1蛋白表达量,对Tim-1和IFN-γ,IL-4之间的关系进行Pearson相关性分析。结果患者组和对照组Tim-1 mRNA分别为0.63±0.40和0.36±0.32,差异具有统计学意义(t=3.005,P=0.003,P<0.01)。患者组与对照组Tim-1蛋白表达水平分别为62.72±38.60和35.66±30.55 pg/ml(t=3.11,P=0.002 8),IFN-γ表达水平分别为200.81±18.06和79.23±20.02 pg/ml(t=25.51,P<0.000 1),IL-4表达水平分别为99.22±14.67和30.18±20.56 pg/ml,差异均具有统计学意义(t=15.46,P<0.000 1)。Pearson相关分析结果提示Tim-1与IFN-γ呈负相关(r=-0.552,P=0.001 1),与IL-4呈正相关(r=0.652,P<0.000 1)。结论Tim-1可能参与了PBC的发病机制,是该病潜在的标志物和治疗靶点。     

Caspase在原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞的表达及其临床意义

目的检测caspase8和caspase3在原发性胆汁性肝硬化(PBC,primary biliary cirrhosis)患者外周血单个核细胞中的表达,探讨其与PBC疾病进展的相关性。方法采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法,检测30例PBC和30例正常对照者的外周血单个核细胞(PBMCs)中caspase8和caspase3的基因和蛋白表达。结果PBC患者PBMCs中的caspase8和caspase3的mRNA和蛋白的表达明显低于健康对照组(P<0.05)。结论PBC患者caspase8,3的表达与疾病的发生发展存在一定的相关性,可以为PBC的诊断和预防提供新线索。     

βB2晶状体蛋白对小鼠卵巢发育及动情周期的影响

目的:初步探讨βB2晶状体蛋白(Crybb2)参与调节生殖过程的作用机制。方法:选取11-13周龄βB2基因敲除(KO组,n=19)与野生型C57BL/C(WT组,n=23)雌性小鼠,阴道涂片观察动情周期变化;HE染色观察卵巢病理变化;光学显微镜下计数卵巢最大切面原始卵泡、初级卵泡、闭锁卵泡;Western blotting和免疫组织化学确定βB2晶状体蛋白在卵巢组织中的表达与定位。结果:βB2晶状体蛋白主要表达在WT组小鼠卵巢颗粒细胞内。与WT组小鼠相比,KO组小鼠卵巢相对重量减轻,动情周期紊乱,原始卵泡、初级卵泡减少,闭锁卵泡增多。结论:βB2基因敲除小鼠的动情周期及卵巢发育异常,βB2晶状体蛋白对小鼠卵巢的发育有重要影响。     

结核杆菌Rv0309重组蛋白的免疫原性研究

Rv0309重组蛋白可引导重组蛋白进入抗原提呈细胞，本文进行了免疫原性的观察。     

APRIL／BlyS表达与原发性胆汁性肝硬化的关联性研究

目的 探讨APRIL/BlyS在原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中的mRNA表达水平以及与体液免疫水平的关联性.方法 设计特异性的引物和探针,以人基因GAPDH为内参照,用实时定量PCR的方法检测42例健康人和56例原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中APRIL,BlyS的mRNA表达水平,采用ELISA方法在全自动酶标仪上检测血清中IgG,IgA,IgM的浓度.结果 与健康人比较,原发性胆汁性肝硬化患者外周血中APRIL,BlyS mRNA的表达升高(P<0.01),患者血清中IgM显著增高(P<0.01),患者中BlyS mRNA表达与IgM成显著正相关(r=0.763,P<0.01),而APRIL mRNA的表达与IgM的水平无相关性.结论 ARPIL,BlyS系统及其受体可能参与原发性胆汁性肝硬化的疾病进程,为监控原发性胆汁性肝硬化的病情和有效治疗提供了新的依据.