运用酵母双杂交系统筛选肌营养不良相关蛋白2(DRP2)相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交系统筛选小鼠、大鼠、人类大脑文库中与DRP2相互作用的蛋白,分析中枢神经系统中DRP2分子复合体的组成成分。方法设计3个含有DRP2不同蛋白结构域的诱饵质粒,在完成诱饵质粒的自激活性的鉴定后,对小鼠、大鼠、人类脑MATCHMAKER cDNA文库进行筛选。结果运用DRP2蛋白N-Bait筛选大鼠脑MATCHMAKER cDNA文库,笔者获得了一个阳性文库质粒。该质粒的插入子编码一种SNAP25相互作用的蛋白质Scoilin。Scoilin又被命名为Zwint-1蛋白。同时笔者还确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域:DRP2蛋白以其含有两个Spectrin重复和一个WW蛋白结构域的氨基端与Scoilin(Zwint-1)全蛋白相互作用。结论应用酵母双杂交,笔者于大鼠大脑中找到了DRP2的相互作用的蛋白质Scoilin(Zwint-1),并且确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域。     

大鼠心肌缺血预适应延迟相的差异蛋白质的分离及鉴定

目的采用蛋白质组学技术探讨缺血预适应心肌内源性保护的分子机制。方法应用双向凝胶电泳技术分离假手术组和心肌缺血预适应延迟相组大鼠的心肌总蛋白质。结果在假手术组的双向凝胶电泳图谱上展示704±27个蛋白质点,而在心肌缺血预适应延迟相组展示778±35个蛋白质点。经凝胶图像分析找到的差异蛋白质23个,基质辅助激光解析—电离飞行时间质谱对差异蛋白进行鉴定,共鉴定出12个蛋白质。这些蛋白质包括应激反应蛋白、代谢相关蛋白、信号调节蛋白、结构蛋白等。结论这些差异蛋白可能通过其分子伴侣功能、清除自由基、改善能量代谢等发挥心肌缺血预适应延迟相的心肌保护作用。     

医学八年制学生科研创新能力的培养

科研创新能力的培养,对医学八年制学生来说是非常重要的,是其基本素质和发展潜力培养的一个关键环节,关系到他们能否适应21世纪国际医学的科技竞争。如何提高八年制医学生科研创新能力,是当前医学教育工作者共同关心与探讨的问题。中南大学湘雅医学院国家级重点学科、国家级精品课程病理生理学在这方面进行了长期有效的探索,提出了探索性实验教学模式。以一种＂短、平、快＂的培养模式,较好地弥补了八年制学生科研创新能力培养全面性和系统性的不足。     

核仁素反义寡核苷酸对RAW264.7细胞增殖与凋亡的影响

【目的】探讨核仁素反义寡核苷酸对RAW264．7细胞增殖与凋亡的影响。【方法】采用反义寡核苷酸技术以抑制RAW264．7细胞中核仁素的表达后,用MTT法检测细胞增殖状况,流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。【结果】免疫印迹结果显示,反义寡核苷酸导入细胞后24h,核仁素的表达被显著抑制,同时反义寡核苷酸处理组细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞凋亡百分率显著升高,并能检测到清晰的“梯状条带”。而正义及随机寡核苷酸导入细胞后不能降低核仁素的表达,对细胞增殖及凋亡均无明显影响。【结论】核仁素表达下调能抑制RAW264．7细胞增殖并能触发RAW264．7细胞凋亡。     

热休克因子1调控的细胞凋亡相关基因的筛选与鉴定

[目的] 观察热休克因子1在热休克反应时对细胞凋亡相关基因表达的调控，同时筛选和初步鉴定热休克因子1调控的下游凋亡相关基因。方法 采用热休克因子1基因敲除小鼠热休克反应模型，抽提热休克因子1基因敲除小鼠和野生型小鼠心肌和肺组织的总RNA进行基因芯片实验，观察凋亡相关基因表达的情况；同时采用生物信息学技术对上述差异表达基因的启动子区进行分析，筛选含有热休克元件的基因；通过逆转录一聚合酶链反应进一步验证热休克因子1对上述基因表达的调控。结果 热休克反应后，野生型小鼠与热休克因子1基因敲除小鼠组织中差异表达的细胞凋亡相关基因有40个。经Genomatix和TESS软件分析发现其中Fasl、Fas、Bim、Bak等8个基因的启动子区含有热休克因子1结合位点。经逆转录一聚合酶链反应证实，热休克反应使Fasl在热休克因子1基因敲除小鼠的表达较野生型小鼠明显增高，而在稳定转染热休克因子1的Raw264.7细胞，Fasl的表达较转空载体细胞明显降低。结论 热休克因子1可调控FasL等多个细胞凋亡相关基因的表达。     

羟乙基淀粉溶液在复苏肠缺血再灌注休克中的作用

目的　比较不同剂量羟乙基淀粉溶液 ( HES)对兔肠缺血再灌注损伤所致休克的复苏作用。方法　 32只新西兰白兔随机分为 4组 :模型对照、乳酸林格液复苏组 ( L RS,2 0 m l· kg- 1 · h- 1 ) ,小剂量 HES复苏组 ( HES2 ml· kg- 1· h- 1 L RS18m l· kg- 1· h- 1 ) ,大剂量 HES复苏组 ( HES2 0 ml· kg- 1· h- 1 )。采用肠系膜上动脉夹闭 6 0 m in后松夹行再灌注制备肠缺血再灌注休克模型 ,松夹再灌注时同步进行液体复苏。观测各时间点的血流动力学参数 (平均动脉压、心率、心排血量、肠系膜上动脉血流 ) ,并通过测定肠黏膜CO2 分压和动脉血 CO2 分压的差值 (动脉二氧化碳间隙 )、肠黏膜 p H值、动脉血乳酸浓度和氧输送等指标间接评估组织氧合情况。实验结束后累计动物死亡数。结果　 HES能明显提高肠缺血再灌注休克时的血流动力学参数 ,与对照组和 L RS组比较差异均有显著性 ( P均 <0 .0 5 ) ;小剂量 HES比大剂量 HES改善血流动力学参数的作用更平稳 ( P均 <0 .0 5 ) ,且较其他 3组能明显降低血乳酸浓度和动脉二氧化碳间隙 ,减轻 p Hi的降低 ( P均 <0 .0 5 ) ;而大剂量 HES对上述参数的影响不明显 ,并可见动物口鼻出血及死亡 ;小剂量或大剂量HES与其他两组比较均能使氧输送回升 ( P均 <0 .0 5 )。结     

氧化应激所致C2C12肌源细胞核仁损伤的分子机制

目的探讨氧化应激诱导细胞核仁损伤的分子机制.方法向传代培养的C2C12肌源细胞中加入0.5mmol/L过氧化氢以模拟氧化应激.结果甲苯胺兰染色发现正常C2C12细胞可见一个位于中央的,浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离,处理6h最为明显.细胞总蛋白质合成能力分析发现过氧化氢处理后6h细胞总蛋白质合成能力显著下降(与正常对照比P＜O.05),并持续至24h.免疫印迹检测核仁素(又称C23)发现,过氧化氢处理1h后可见-80kDa条带,而其110kDa主带明显减弱,过氧化氢处理6h和12h最为明显.用脂质体将核仁素反义核酸导入细胞后24h,免疫印迹发现核仁素表达明显被抑制,同时也可观察到细胞总蛋白合成能力下降及明显的核仁分离.结论氧化应激通过诱导核仁蛋白质核仁素的裂解并使其110kDa全长分子的量减少,而导致C2Cl2细胞核仁损伤.     

膜表面核仁素对内毒素所致THP-1细胞炎症介质表达的影响

目的探讨THP-1细胞膜定位核仁素作为寡糖链受体在脂多糖所致炎症反应中的作用。方法采用间接免疫荧光、流式细胞术以及细胞膜蛋白免疫印迹等技术证实核仁素在人THP-1细胞膜表面表达。以无血清状态下脂多糖刺激THP-1细胞为炎症细胞模型，采用逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定法等检测核仁素抗体对炎症介质肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与分泌的影响。结果间接免疫荧光、流式细胞术以及免疫印迹证实核仁素可在人THP-1细胞膜表面表达。逆转录聚合酶链反应结果发现，在无血清条件下，500μg/L脂多糖刺激1h、2h、3h或4h后可以明显促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达，而核仁素抗体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达明显受到抑制。而先用正常IgG体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与单用脂多糖刺激水平相当。另外单用正常IgG或核仁素抗体处理1～4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与对照组比较无差异。酶联免疫吸附测定法检测发现，核仁素抗体处理1h后能明显抑制脂多糖所致肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，而IgG则没有这种作用。结论THP-1细胞膜表面核仁素参与了脂多糖所致炎症反应，提示核仁素可能是脂多糖的一种新受体。     

大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达

目的：探讨腹主动脉缩窄致压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中核仁素的表达情况。方法：采用体质量
180~220 g SD大鼠40只,随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组,利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加心肌肥
厚模型,分别于术后2周、4周观察心脏质量指数、左心室质量指数;采用RT-PCR检测心肌组织中-MHC mRNA的
表达;采用Western印迹检测心肌、脑、肾组织中核仁素的表达情况。结果：腹主动脉缩窄模型组4周以后心脏质量
指数、左心室质量指数较假手术组显著增加(P<0.01);4周以后心肌组织中-MHC mRNA的表达较假手术组显著升高
(P<0.05);2周以后心肌组织中核仁素蛋白的表达较假手术组显著升高(P<0.05),而在脑、肾组织中无明显升高。结论：
核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达上调,表明核仁素可能参与了压力负荷增加心肌肥厚的发生
发展。     

Krüppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的 探讨Krüppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响.方法 采用热应激(42.5℃)处理Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞1 h,37℃恢复12 h;采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达.结果 流式细胞术结果发现,两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高,但与转空载体组相比较Krüppel样因子4过表达组升高更明显,凋亡百分率达19.6%;荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变;Krüppel样因子4组细胞经Western blot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变.结论 Krüppel样因子4可以诱导热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡.