MiR-138对MCF-7细胞端粒酶活性及端粒稳定性的调控作用

 目的 研究MiR-138通过HTERT作为下游靶基因,对人乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性的调控作用及端粒稳定性的影响。方法 在人乳腺癌MCF-7细胞中瞬时转染MiR-138 模拟物,用MTT法检测细胞增殖活性,并于转染后48h,用实时定量RT-PCR检测端粒酶催化亚单位HTERT表达、TRAP Assay检测端粒酶活性,同时对细胞进行53BP1 抗体免疫荧光染色及端粒的FISH染色。结果 转染后48h,MiR-138模拟物处理的MCF-7细胞HTERT表达水平比对照细胞降低2.18倍(2-△△Ct),端粒酶活性比对照细胞降低2.69倍,53BP1聚集形成的凝集点（Foci）,部分与端粒位点重合,比率达到20.62%±1.55% 。结论 MiR-138以HTERT作为下游靶分子,调控MCF-7细胞端粒酶活性,影响细胞端粒稳定性。     

bcr-abl基因沉默对相关基因表达的影响

目的运用RNAi技术,研究使bcr-abl基因沉默后相关基因表达变化。方法针对bcr-abl基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行细胞计数及流式细胞仪检测,观察干扰效果,应用RT-PCR检测相关基因表达变化。结果转染组与对照组相比,细胞数减少,有明显的细胞凋亡,bcr-abl,N-ras,c-myc基因的mRNA表达量降低。结论运用RNAi技术,可以有效地诱导细胞凋亡,抑制相关基因的表达,为研究CML的发生机制奠定基础。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA,并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体,挑选阳性克隆,用PCR扩增,以纯化的PCR产物做探针,制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头,用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3,与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果芯片杂交结果经扫描分析,发现42个K562细胞肿瘤特异性基因,进一步用序列分析证实,其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因,为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。     

应用70 mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

一种用于微阵列分析的通用引物U2联合标记方法

目的报告一种新的用于微阵列研究的荧光标记技术：通用引物U2联合标记技术(UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法分别用4种标记方法标记流感病毒RNA样品,与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交后,用Spss10．0软件对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法是一种新颖而有效的标记方法,在微阵列技术研究方面具有广泛的应用价值。     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的 运用RNAi技术,设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA),研究其干扰效果。方法 针对c-mycmRNA的第1357靶位点设计siRNAs,经Lipofectamine^TM2000脂质体法转染K562细胞,进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-mycmRNA表达明显减弱,细胞计数和MTTD(λ)值均有显著降低,并有明显的凋亡率。结论 运用RNAi技术,可以有效地干扰c-myc的表达,并进一步诱导细胞凋亡。     

慢性髓细胞性白血病患者与健康人骨髓单个核细胞基因表达的差异

背景：慢性髓细胞性白血病是以造血干细胞的恶性克隆性增殖为特征。慢性期的慢性髓细胞性白血病患者如果不予以有效的治疗，必然演进为急变期。其预后往往非常差。因而，从全基因组水平上阐明慢性髓细胞性白血病的发生机制显得尤为重要，目的：应用Applied Biosystems表达芯片系统对慢性髓细胞性白血病患者骨髓单个核细胞的基因表达谱进行观察。设计：观察对比分析。单位：南方医科大学基因工程研究所。对象：两例骨髓样品（1例慢性髓细胞性白血病患者，1例健康者）来自于广州军区广州总医院血液科。方法：实验于2004-10／2005—09在南方医科大学基因工程研究所完成。分别从一例慢性髓细胞性白血病患者与一例健康人的骨髓样品中分离单个核细胞，提取总RNA，纯化mRNA。通过逆转录体外线性扩增的方法对mRNA样品进行标记，将标记好的cRNA样品与芯片杂交。利用ABI1700化学发光芯片分析仪对骨髓单个核细胞的基因表达谱差异情况进行分析。通过比较同一样品不同芯片间的数据信息，对芯片结果的可重复性进行评估。主要观察指标：①总RNA及标记后的cRNA质量的评定。②芯片可重复性验证。③芯片杂交结果。④半定量反转录-聚合酶链反应结果。结果：①利用统计学数据分析工具，通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达差异，总共发现了6706个差异基因。其中，与慢性髓细胞性白血病密切相关的差异基因为68个，上调的有17个，下调的有51个。③位于C／EBPalpha信号通路和CD40受体信号通路中的大部分差异表达基因，其表达水平降低。③通过对重复实验结果的相关性及检测一致性分析，证实了芯片结果的可重复性较好。而两组重复实验间的相关系数分别是，慢性髓细胞性白血病组为0．991，健康组为0．988。④半定量反转录-聚合酶链反应验证了芯片分析结果的可靠性。结论：通过比较慢性髓细胞性白血病患者与健康人单个核细胞的基因表达谱的差异，发现了大量的差异表达基因。这些数据将为寻找可用于慢性髓细胞性白血病患者疾病治疗的分子靶标提供有用的信息。     

干扰HTERT降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线引起的DNA损伤反应

 目的 研究HTERT RNA干扰对人乳腺癌MCF-7细胞γ射线照射引起的DNA损伤反应的影响。方法 通过逆转录病毒为载体的HTERT-siRNA,抑制人乳腺癌MCF-7细胞中端粒酶催化亚单位HTERT表达,实时定量RT-PCR及Western blot确认HTERT表达水平、用137Cs放射源以3 Gy剂量γ射线照射细胞,于照射前以及照射后1、2、4、8和12h收集细胞,采用磷酸化53BP1 抗体进行免疫荧光染色,并于照射前、照射后1、4和12h收集细胞,Western blot检测53BP1蛋白磷酸化水平。结果 HTERT-siRNA处理的细胞HTERT表达水平比对照细胞降低3.20 (2-△△Ct)倍, HTERT蛋白水平降低2.56倍。HTERT-siRNA处理的细胞对γ射线引起的DNA损伤反应显著降低。结论 RNA干扰HTERT表达水平,可以降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线照射引起的DNA损伤反应。     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的运用RNAi技术，设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA)，研究其干扰效果。方法针对c-myc mRNA的第1357靶位点设计siRNAs，经Lipofectamine^TM 2000脂质体法转染K562细胞，进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果转染组与阴性对照组和空白对照组相比，c-myc mRNA表达明显减弱．细胞计数和MTTD(λ)值均有显降低，并有明显的凋亡率。结论运用RNAi技术，可以有效地干扰c-myc的表达．并进一步诱导细胞凋亡。