人血管内皮生长因子165基因转染对C17-2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的：构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体，并观察其对C17．2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法：将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，经酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165，转染体外培养的C17．2神经干细胞。以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组。通过酶联免疫吸附测定检测其在C17．2神经干细胞中不同时间段的表达。C17．2神经干细胞培养24h后，将pAdcMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组)，24，48，72h后每孔加入四氮唑盐10μL，检测pAdCMV转染对C17．2神经干细胞增殖的影响。将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白，pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞设为对照2组。收集C17．2神经干细胞(C17．2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17．2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17．2神经干细胞组)，对两组细胞进行培养，将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定，行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测。结果：①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功，病毒滴度达2&;#215;10^11efu／L。酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17．2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710&;#177;82)ng／L，明显高于转染前(118&;#177;20)ng／L，第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰，分别为(1110&;#177;126)，(1135&;#177;138)ng／L，此后渐下降，于第13天(355&;#177;35)ng／L仍显著高于对照Ⅰ组(110&;#177;22)ng/L和转染前(t=5．87，P&;lt;0．01)。②C17．2神经干细胞培养24，48，72h后对照2组干细胞增殖率分别为(0．1367&;#177;0．0186)％，(0．3300&;#177;0．0134)％，(0．6603&;#177;0．0207)％，pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17．2神经干细胞24，48，72h后干细胞的增殖率分别为（0．1399&;#177;0．0183)％，(0．3730&;#177;0．0136)％．（0．67l3&;#177;0．233)％。pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17．2神经干细胞24，48，72h后干细胞的增殖率分别为(0．1469&;#177;0．0171)％。(0．3631&;#177;0．0136)％，(0．6353&;#177;0．0247)％。两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较，P&;gt;0．05。pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较，P&;gt;0．05)。③C17．2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15．72&;#177;1．003)％。(17．63&;#177;1．082)％。神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17．63&;#177;1．082)％。(21．49&;#177;1．022)％，两组比较无明显差异(P&;gt;0．05)。结论：成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒，获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆，体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17．2神经干细胞增殖和分化产生影响。     

局灶脑缺血再灌注区脑微血管基底膜损害及uPA、uPAmRNA表达的实验研究

目的:探讨脑缺血再灌注区脑微血管结构损害特征及发生机制。方法:应用光镜、透射电镜、免疫组织化学、原位分子杂交等技术,观察易卒中型肾血管型高血压大鼠局灶脑缺血2h再灌注6h至7d,再灌注区脑微血管结构改变、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达。结果:局灶脑缺血再灌注区的脑水肿加重及并发出血以再灌注12h至3d最为严重,脑微血管基底膜溶解、缺损。同时使基底膜及细胞外间质降解的主要酶类uPA及uPAmRNA表达增加,以再灌注12h至3d达高峰。结论:脑缺血再灌注区脑微血管基底膜破坏是导致再灌注后脑水肿、出血的主要病理基础,内皮细胞、胶质细胞uPA表达的增加可能是引起微血管基底膜及细胞外间质损害的主要机制之一。     

脑缺血后c—fos原癌基因表达的改变

缺血后ｃ－ｆｏｓ表达在神经元可塑性，迟发性神经元坏死，梗塞灶远隔部位神经元损害，神经元的缺血耐受性等方面都有重要意义。现就近５年来国外有关方面的研究综述如下。     

胰岛素对局灶脑缺血c-jun基因表达的影响

目的观察不同剂量胰岛素对高血压大鼠局灶缺血脑组织ｃｊｕｎ基因表达的影响。方法以肾血管性高血压大鼠（ＲＨＲ）复制大脑中动脉闭塞（ＭＣＡＯ）模型,采用原位杂交技术检测不同剂量胰岛素组和对照组ＭＣＡＯ后３ｈ脑组织ｃｊｕｎ基因的表达。结果与对照组相比,在缺血侧广泛的大脑皮层,低剂量胰岛素组ｃｊｕｎｍＲＡＮ有统计学意义的增加（Ｐ＜００５）,而较高剂量胰岛素组ｃｊｕｎｍＲＮＡ增加更为显著（Ｐ＜００１）。结论胰岛素促进缺血脑组织ｃｊｕｎ基因表达可能是其神经保护作用机制之一,而且这种作用呈剂量依赖性。