尿激酶型纤溶酶原激活物及其抑制物-1表达与脑微血管改变的实验研究

目的探讨脑缺血再灌注病灶周围区脑微血管改变及与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1)表达的关系。方法应用光镜、电镜、免疫组织化学、原位分子杂交等技术,观察局灶脑缺血2h再灌注1、7、14、21d病灶周围区脑微血管结构改变及uPA、PAI1表达情况。结果脑缺血2h再灌注7、14d病灶周围区见新生微血管内皮细胞,且uPA、PAI1表达明显增加,uPA阳性单位7、14d分别为6.8±3.9、5.8±2.1,PAI1阳性单位7、14d分别为12.8±2.6、10.7±3.1。结论脑缺血再灌注后期病灶周围区有脑微血管内皮细胞再生,uPA、PAI1可能参与了微血管重建。     

167例微卒中的临床与影像学分析

目的 对167例微卒中患者的临床及影像学(头颅CT,MRI)特点进行分析总结.方法 回顾分析167例微卒中患者的临床及影像学资料.结果 ①微卒中发病年龄高峰为60~79岁,其发生率约占卒中病例的15.8%(167/1052),以腔隙性脑梗塞为最多见61.1%(102/167),其次为短暂性脑缺血发作(TIA)36.5%(61/167),脑内出血2.4%(4/167).②临床表现较隐匿,主要有头痛,头晕,一过性肢体乏力,一过性肢体麻木,晕厥.③伴发的高危因素中,以高血压为最多见.且较高比倒的患者存在Ym.-~增高和c反应蛋白指数增高.④经CT.MRI检查发现143例(85.6%)可见病灶.部位以基底节区最多见,病灶直径多以小于10mm为主.结论 微卒中的临床症状相对较轻,起病形式隐袭.炎症反应可能是微卒中的危险因素之一.微卒中病灶多位于基底节区.     

人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响.方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞.以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组.通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达.C17.2神经干细胞培养24 h后,将pAdCMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72 h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响.将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组.收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测.结果:①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/L.酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710±82)ng/L,明显高于转染前(118±20)ng/L,第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰,分别为(1110±126),(1135±138)ng/L,此后渐下降,于第13天(355±35)ng/L仍显著高于对照1组(¨0±22)ng/L和转染前(t=5.87,P＜0.01).②C17.2神经干细胞培养24,48,72 h后对照2组干细胞增殖率分别为(0.1367 ±0.018 6)%,(0.330 0±0.013 4)%,(0.660 3±0.020 7)%,pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.139 9±0.018 3)%,(0.373 0±0.013 6)%,(0.671 3±0.233)%;pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.146 9±0.0171)%,(0.363 1 ±0.013 6)%,(0.635 3±0.024 7)%.两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较,P＞0.05.pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较,P＞0.05).③C17.2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15.72±1.003)%,(17.63±1.082)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17.63±1.082)%,(21.49±1.022)%,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论:成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒,获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆,体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17.2神经干细胞增殖和分化产生影响.     

TLR9信号通路在大鼠脑梗死灶周围组织中的双向转导

目的 观察Toll样受体9(TLR9)信号通路在大鼠脑梗死灶周围皮质组织中的转导变化. 方法 采用线栓法成功制备48只SD大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,并设置假手术组(24只)作为对照.在脑缺血90 min再灌注6h、3d、7d、14d时分别对大鼠进行神经功能缺损评分,取脑组织行TTC染色以测定梗死体积,取梗死灶周围皮质和对侧相应皮质行Western blotting,测定TLR9、核因子NFκB(P65)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、干扰素调节因子-7(IRF7)、干扰素-3(IFNβ)的蛋白表达水平. 结果 再灌注6h、3d、7d、14d时,模型组大鼠的神经功能缺损评分和梗死体积随时间的延长逐渐减小;梗死侧TLR9、IRF7、IFNβ蛋白的表达逐渐增加,而NFκB(P65)、TNFα蛋白的表达呈先上升后下降的趋势,表达高峰在7d.同一蛋白的表达量在不同时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);同一观察时间点比较,梗死侧各蛋白的表达量高于对侧相应皮质,差异有统计学意义(P＜0.05).再灌注6h、3d和7d时NFKB(P65)、TNF-α蛋白表达分别高于IRF7、IFNβ,而再灌注14d时NFκB(P65)、TNFα蛋白表达分别低于IRF7、IFNβ,差异均有统计学意义(P＜0.05).在假手术组各时间点均未检测到上述蛋白的表达. 结论 大鼠短暂性脑缺血再灌注后,TLR9的炎症通路和细胞保护通路相继被激活,可能参与了脑梗死后炎症损伤和组织修复过程.     

大鼠脑梗死后缺氧组织显像的动态变化

【目的】 研究大鼠脑梗死后缺氧组织是否能长期存在及其动态变化。 【方法】 利用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,分别采用99Tcm-HL91放射自显影和EF5免疫荧光的方法进行缺氧显像。分持续缺血组(PI)、1.5 h缺血再灌注组(1.5 h IR)、2 h缺血再灌注组和3 h缺血再灌注组4组,放射自显影的观察时间点选取手术后1 d和14 d,免疫荧光则选取术后1、3、7、14、21 d,每个时间点各3只大鼠。【结果】 放射自显影显示1.5 h IR组手术后1 d和14 d均为缺氧阳性,其余各组均阴性;免疫荧光示1.5 h IR组术后1、3、7和14 d均有缺氧组织,面积(um2)有缩小倾向(分别为21 478 ± 8 254、 4 405 ± 1 490、2 647 ± 463和1 612 ± 239),但荧光强度没有明显减弱(分别为1.66 ± 0.07、1.75 ± 0.02、1.68 ± 0.08和1.64 ± 0.01);而其余各组在术后7 d均已无缺氧组织。【结论】 与人类脑梗死相似,大鼠脑梗死后缺氧组织可存在较长时间,且随着时间的延长而逐渐减少;1.5 h IR的大鼠MCAO模型是研究脑梗死后缺氧组织长时间存在的合适模型。     

有效抑制小鼠小胶质细胞上Toll样受体9表达的siRNA的筛选

目的：筛选有效抑制小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）上Toll样受体9（TLR9）表达的小干扰RNA（siRNA）序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR9的3对siRNA（siRNA-836、siRNA-1549和siRNA-2410）及一条带绿色荧光标记（FAM）的通用阴性对照FAM-siRNA。在X-tremeGENEsiRNA转染试剂介导下转染BV-2细胞。倒置荧光显微镜下观察转染后BV-2细胞FAM-siRNA的分布,流式细胞仪检测转染效率,q-PCR检测TLR9的mRNA表达,Westernblot检测TLR9蛋白的表达,并比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。CCK-8检测细胞存活率的变化。结果BV-2细胞转染FAM-siRNA后6h,胞质内可见绿色荧光分布。FAM-siRNA表达阳性率为（91.87±4.77）％。转染TLR9siRNA后,BV-2细胞中TLR9mRNA表达明显下降。与阴性对照组及序列siRNA-836、siRNA-2410相比,序列siRNA-1549的TLR9沉默效能最高,使BV-2细胞上TLR9mRNA表达于24h和48h分别降低（77.89±4.23）％和（65.36±11.07）％,TLR9蛋白表达分别下降（48.37±20.56）％和（44.30±14.31）％。CCK-8检测TLR9siRNA转染组与对照组相应时间点比较,BV-2细胞存活率无明显变化（P＞0.05）。结论序列siRNA-1549对BV-2细胞上TLR9表达的抑制效果最大,利用RNA干扰处理BV-2细胞,对细胞基本无毒性作用。     

脑梗死患者的99mTc-HL91 SPECT乏氧显像

目的^99m Tc-HL91 SPECT检测不同亚型脑梗死患者的乏氧组织,探讨乏氧组织能否代表缺血半暗带。方法：对57例发病14d内的脑梗死患者和9例无脑病的对照者行辨^99m Tc-HL91 SPECT脑乏氧显像,显示乏氧组织。其中5例患者同时进行^99m Tc-HL91 SPECT脑血流灌注显像,1例患者行”F-FDG葡萄糖代谢显像。结果：对照组乏氧显像全部为阴性,30例脑梗死患者呈阳性,均为完全或部分前循环梗死,乏氧组织位于梗死灶外周。10例复查乏氧显像的患者乏氧组织均缩小或消失,其中1例乏氧组织持续存在至发病后第44天。脑血流显像提示,梗死侧大脑半球血流下降,其中2例乏氧显像呈阳性。葡萄糖显像提示,患者在发病后17d时梗死灶仍存在葡萄糖代谢,乏氧显像仍呈阳性。结论：一部分完全或部分前循环梗死患者存在乏氧组织,该组织代表可逆性损伤组织,可持续存在至亚急性期和慢性期。     

99Tcm-HL91 SPECT脑显像显示急性脑梗死患者存活脑组织的初步研究

目的 观察99Tcm-HL91 SPECT脑显像能否显示急性脑梗死的乏氧组织(处于缺血缺氧状态但尚存活的脑组织)。方法 起病96小时内的大脑半球梗死患者行99Tcm-HL91 SPECT脑显像和同机CT扫描,并进行图像融合。在连续2个以上层面和两个以上不同轴向断层上,在梗死侧大脑半球出现放射性浓集区,为乏氧显像阳性。结果43例患者中,乏氧显像阳性者24例,均属完全或部分前循环梗塞。乏氧显像区位于梗死灶周围。9例住起病后7～17天复查SPECT,仍呈阳性,但乏氧组织已减少。腔隙性梗死者,乏氧显像均阴性。结论99Tcm-HL91 SPECT显像能清晰地显示完全及部分前循环梗塞患者的脑乏氧组织,能提示急性脑梗死后脑组织的存活,有助于指导治疗。     

脑缺血后c-fos原癌基因表达的改变

缺血后c-fos表达在神经元可塑性、迟发性神经元坏死、梗塞灶远隔部位神经元损害、神经元的缺血耐受性等方面都有重要意义。现就近5年来国外有关方面的研究综述如下。     

大活络胶囊治疗急性脑梗死的疗效观察──附300例报道

目的观察大活络胶囊治疗急性脑梗死的临床疗效。方法通过8家医院进行多中心联合观察,按入院顺序将600例急性脑梗死患者随机分为治疗组300例和对照组300例,两组患者均接受阿司匹林100 mg,每日1次;静脉滴注250 mL含30 mL复方血栓通注射液的生理盐水,每日1次;治疗组另口服6颗大活络胶囊,每日3次;14 d为1个疗程,2个疗程间停药7 d,两组皆治疗2个疗程,视患者病情及并发症给予脑保护、脱水、降血压、降糖等对症治疗,未使用除阿司匹林外其他影响血液流变学的药物。结果与对照组相比,治疗组总有效率明显增高(93.00%Vs 87.67%,P<0.05),NIHSS神经功能缺损评分明显减少(5.22±2.78 Vs 5.91±2.02,P<0.05),中医症候积分明显减少(肢体活动不遂、语言蹇涩、口舌歪斜、感觉异常P<0.01,舌苔脉象P<0.05),脑梗死体积明显减小(10.22±4.37Vs 11.51±3.98,P<0.01),全血黏度明显下降(9.07±1.22 Vs 9.51±1.01,P<0.05),血纤维蛋白原含量明显下降(4.10±0.68 Vs 4.39±0.44,P<0.05),红细胞聚集指数明显下降(39.71±3.96 Vs 42.56±4.43,P<0.05),血胆固醇及三酰甘油明显降低(6.00±0.95 Vs 6.23±0.67,1.72±0.69 Vs 1.94±0.91,P<0.05),共出现不良反应5例,其中2例轻度头痛,3例轻度恶心。结论大活络胶囊治疗急性脑梗死疗效明显,不良反应少。