幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

抛锚式教学法在临床医学八年制内科学实践教学应用初探

八年制医学教育的开展对传统的内科学临床实践教学提出了全新的要求。抛锚式教学法强调以学生为中心,使学生在一个完整、真实的问题背景中产生学习的需要,凭借自主学习、生成学习、合作学习,最终在教师的引导下解决问题。文章介绍了湘雅三医院内科教研室利用该教学法进行临床见习带教的过程,取得了较好的教学效果。从内科学实践教学入手,采用抛锚式教学法,可有效提高八年制医学生的见习效果和临床实践能力,有利于高素质医学人才的培养。     

临床医学八年制双语教学问卷调查分析与启示

目的:了解中南大学湘雅医学院2006级临床医学八年制双语教学情况,深化双语教学改革。方法:对该校临床医学八年制共97名学生的双语教学情况进行半开放问卷调查。结果:学生医学专业词汇量不能很好地满足需要;学生对老师的满意度一般,希望使用英文原版教材;双语教学的考核和监督应多元化。结论:对学生应提早进行专业英语教育,加强师资力量培养,进一步优化双语教学资源及模式,完善考核监督。     

miR-126靶向调控IRS1,SLC7A5及TOM1基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移

目的: 通过研究miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞生物学行为的影响,了解miR-126在结肠癌发生发展中的作用。方法: 利用原位杂交在高密度人结肠癌组织芯片中研究miR-126的表达,通过慢病毒转染构建miR-126稳定过表达细胞系,并进一步通过体外实验研究miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果: miR-126在人结肠癌组织中表达下调,在存在侵袭转移患者的结肠癌组织中下调尤为明显。miR-126的表达与患者是否发生转移及结肠癌临床分期、Duke's分期相关(P<0.05),且miR-126下调越明显,患者预后越差(P=0.025)。利用慢病毒转染构建的miR-126过表达SW480细胞系进行体外实验显示结肠癌细胞中恢复miR-126的表达可抑制结肠癌细胞增殖,使其出现G1期阻滞并促进结肠癌细胞凋亡、抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力。同时miR-126可明显增强结肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性。进一步生物信息学分析及qRT-PCR结合蛋白免疫印迹法验证IRS1,SLC7A5及TOM1可能为miR-126在结肠癌中的靶基因。结论: miR-126可明显抑制结肠癌的发生发展,且与结肠癌患者预后密切相关,其可能调控的靶基因为IRS1,SLC7A5及TOM1,miR-126有望成为结肠癌临床诊断及治疗的新靶点。     

BRD7基因在急性白血病细胞中的表达及SNP分析

目的:探讨BRD7基因在急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(BMNCs)中的表达水平及单核苷酸多态性(SNP)分布.方法:采用半定量RT-PCR方法检测52例AL患者及30例非恶性血液病对照的BMNCs BRD7基因的表达水平,并应用单链构象多态性加直接测序法检测BRD7基因点突变或SNP,分析BRD7基因与AL的相关性.结果:在52例AL患者和30例对照组患者中均存在BRD7基因表达.急性淋巴细胞白血病(ALL)患者和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者BRD7 mRNA的相对表达量均高于对照组(P＝0.001;P＝0.037).BRD7基因编码区(447～844 bp)存在3个cSNPs,即C657A,C495T和A737G,其中C495T和A737G偶联发生.C657A多态性的基因频率在AL组和对照中差异无统计学意义.两个偶联的SNPs等位基因频率及基因型频率在AL组和对照中差异存在统计学意义(P＜0.01);但在AL组中3种基因型之间BRD7 mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:BRD7基因在急性白血病患者细胞中表达上调.BRD7基因编码区(447～844 bp)2个偶联SNPs (C495T和A737G)与AL存在相关性,可能是AL的遗传易感因子之一.     

青年人群上消化道内镜下诊治术前镇静特点探讨

目的比较不同年龄人群上消化道内镜下诊治术前镇静时的用药量及镇静效果,探讨在青年人群中实施镇静性上消化道内镜术的镇静特点.方法共266人(18-60岁)接受镇静性上消化道内镜术,分为A组(青年组,n=168,18～35岁)及B组(n=98,36～60岁).术前均给予利多卡因咽喉麻醉及吸氧,内镜术前均给予咪唑安定0.02～0.05mg/kg(Range1.0～1.5mg),异丙酚0.5～2.5mg/kg(Range 40～175 mg),待受检者呼之不能应答,睫毛反射消失、氧饱和度＞95%开始进镜,术中酌情追加异丙酚用量.结果A组(青年组)异丙酚初始剂量及总剂量均显著高于B组(P＜0.001);患者评估两组均有较好的镇静质量及记忆缺失效果,操作者评估A组镇静质量明显低于B组(P＜0.001);两组相比血压的影响差异无显著性(P＞0.05),两组间脉率、氧饱和度差异亦无显著性;两组脉率、血压、氧饱和度的严重不良事件发生率比较差异无显著性(P＞0.05).结论在实施镇静性上消化道内镜术时,青年人群异丙酚用量明显增加.如果适当增加青年人群咪唑安定的剂量,同时消除其紧张焦虑情绪,可望保证镇静质量、更好地诱导麻醉,使内镜操作过程更顺利.     

细胞连接蛋白基因在胃癌中的表达研究

目的： 为了系统研究人胃癌基因组中Ｃｘ 基因的表达状况。方法： 本文采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交和ＲＴＰＣＲ 方法, 对１５ 例人胃癌组织、配对癌旁组织、正常组织及人胃腺癌ＭＧＣ８０３ 细胞株的Ｃｘ２６ 、Ｃｘ３１－１ 、Ｃｘ３２ 、Ｃｘ３３、Ｃｘ３７ 、Ｃｘ４０、Ｃｘ４３ 、Ｃｘ４６ 八种Ｃｘ 基因表达进行了一系列检测。结果：发现在人正常胃粘膜上皮中高水平表达而在胃癌中表达极其微弱或根本无表达的细胞连接蛋白基因的表达规律,首次明确了Ｃｘ 基因在人胃癌基因组中的表达谱。其中人正常胃粘膜上皮细胞中Ｃｘ３２ 、Ｃｘ３７ 、Ｃｘ４３ 在ｍ ＲＮＡ 水平上有高水平表达; 与正常相反, 人胃癌细胞除Ｃｘ４３ 在ｍ ＲＮＡ 水平上有低水平表达外, 其他连接蛋白基因均无转录活性; 而人胃腺癌ＭＧＣ８０３ 细胞株中, Ｃｘ３７ 、Ｃｘ４６ 在ｍ ＲＮＡ 水平上有一定程度的表达。结论：本研究表明Ｃｘ３２ 可能是人胃上皮细胞基因组中维持细胞间隙连接通讯功能的特异表达的Ｃｘ 基因,Ｃｘ４６ 可能是胃癌Ｃｘ 基因表达的一种变异。Ｃｘ３７、Ｃｘ４３ 不是人胃上皮细胞的特异表达基因。本研究证实了Ｃｘ 基因在肿瘤细胞中表达下调,Ｃｘ 基因具有潜在的抑瘤基因的生物学活性。     

亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白

目的：利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和 S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法：构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标 签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标 签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共 沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果：通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,eIF5A 等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进 行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、 抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生 相互作用。结论：利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐 明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。     

抗CXCL1中和抗体在急性溃疡性结肠炎小鼠模型中的治疗作用

目的：探讨抗CXC趋化因子配体1(CXCL1)中和抗体对葡聚糖硫酸钠(dextra sulfate sodium,DSS)诱导的 急性溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠模型的治疗作用,并阐明其对结肠组织中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL- 17,IL-10的表达及中性粒细胞浸润的影响。方法：雌性BALB/c小鼠48只,随机分为正常对照组(DSS-)、疾病组 (DSS+saline)、抗CXCL1中和抗体治疗组(DSS+anti-CXCL1 Ab)和治疗对照组(DSS+IgG Ab),每组12只。正常对照组小 鼠给予蒸馏水自由饮用,疾病组、治疗组及治疗对照组给予3.5%的DSS自由饮用,至第8天处理小鼠。其中治疗组于 造模第3天和第6天腹腔注射抗CXCL1中和抗体(4 mg/kg),治疗对照组予以等量大鼠IgG抗体,正常对照组和疾病组 注射等量生理盐水。对各组小鼠进行疾病活动指数评分(disease activity index,DAI)及结直肠组织损伤学评分,并采用 RT-PCR法检测各组小鼠结肠组织中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-17和IL-10的表达。运用免疫组织化学检测各组小鼠 结肠组织中中性粒细胞特异性标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的表达。结果：与正常对照组相比,疾病 组小鼠DAI评分及结直肠组织损伤学评分明显增高,但是予以抗CXCL1中和抗体干预治疗后能明显减低急性UC小鼠 的DAI和结直肠组织损伤学评分。RT-PCR检测结果显示：与正常对照组相比,疾病组小鼠结直肠组织中促炎细胞因 子TNF-α,IFN-γ和IL-17 mRNA表达水平均显著升高,抑炎因子IL-10 mRNA表达下降。而使用抗CXCL1中和抗体干预 治疗,明显抑制DSS诱导的小鼠结肠组织中促炎细胞因子TNF-α,IFN-γ和IL-17 mRNA表达水平的升高及抑炎因子IL- 10 mRNA表达水平的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示：疾病组小鼠结肠组织中中性粒 细胞的浸润明显增加,予以抗CXCL1中和抗体治疗能显著减少结肠组织中中性粒细胞的浸润,差异具有统计学意义 (P<0.05)。结论：抗CXCL1中和抗体缓解了DSS诱导的急性UC的进展,其发挥抗炎作用的机制可能与抑制促炎因子的 表达和中性粒细胞的浸润有关。     

单链构象多肽性检测人胃癌中Cx43基因点突变

目的进一步探讨人胃癌基因组中Cx43基因表达下调的分子机制。方法运用RT-PCR-SSCP，方法对30例人胃癌活检组织及其相应配对正常组织的Cx43基因编码区进行突变检测。结果30例人胃癌活检组织未发现突变。结论Cx43基因在人胃癌中表达下调的原因不是其基因编码区的点突变，其表达下调的原因可能与其非编码区序列，尤其是5’端调控区序列的结构改变有关，这为进一步研究Cx基因在胃癌发生中的作用打下了一定基础。SSCP方法检测突变有效、快速、经济、无放射线污染，它可能作为胃癌基因诊断的筛选方法之一。