增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化

目的:制备及纯化针对增殖诱导配体基因(APRIL)的小干扰RNA(APRIL siRNA),为进一步研究APRIL基因在人胰腺癌中的作用奠定基础.方法:构建靶向胰腺癌CFPAC-1细胞株APRIL基因双链RNA(APRIL dsRNA)的表达质粒pET-22b-APRIL, 在大肠杆菌中发酵表达APRIL dsRNA,并利用CF-11树脂亲和层析纯化;用大肠杆菌Ⅲ型RNA水解酶(RNase Ⅲ)水解dsRNA,制备APRIL siRNA,应用DEAE树脂离子交换层析使RNaseⅢ与核苷酸分离,分子筛层析进一步分离纯化APRIL siRNA.将纯化后的APRIL siRNA转染CHO细胞,荧光显微镜下观察转染后CHO细胞APRIL蛋白的表达情况.结果:pET-22b-APRIL转染大肠杆菌后,经IPTG诱导能大量表达APRIL dsRNA,表达产物经CF-11树脂纯化能得到纯化的APRIL dsRNA;dsRNA经RNase Ⅲ水解后,过DEAE树脂离子交换层析柱,经5%PAGE、12%SDS-PAGE电泳证实RNase Ⅲ与核苷酸分离,进一步经分子筛层析分离纯化,得到纯化APRIL siRNA.荧光显微镜下观察结果表明,APRIL siRNA转染CHO细胞能明显抑制APRIL蛋白的表达.结论:成功制备了靶向CFPAC-1细胞株的APRIL siRNA,为下一步敲减CFPAC-1细胞APRIL基因的研究奠定了基础.     

小干扰RNA沉默鸟苷酰环化酶C基因促进胃癌细胞的凋亡

目的:利用RNA干扰技术,研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclaseC,GC-C)的小干扰RNA(siRNA)在体外对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法:利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA,将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,流式细胞检测技术及原位末端标记(TUNEL)法检测转染前后细胞的凋亡。结果:流式细胞仪结果分析示转染组平均凋亡率为5.48%±0.10%(48h)和5.63%±0.11%(72h),较对照组0.50%±0.09%明显增加(P<0.05)。TUNEL检测见特有的凋亡征象,对照组则无明显变化。结论:沉默鸟苷酰环化酶C基因可促进胃癌细胞凋亡,可能为临床探索胃癌生物治疗提供新的靶点。     

增殖诱导配体及其受体在肿瘤组织中的表达与意义

目的分析增殖诱导配体(APRIL)及其受体在不同肿瘤组织及肿瘤发展不同阶段的表达水平,探讨其与肿瘤发生的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测了临床上常见肿瘤组织中APRIL及其受体mRNA的准确含量,并以靶基因和内参mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果肿瘤组织中APRIL表达水平显著高于交界组织(P<0.05)和正常组织(P<0.05);B细胞成熟抗原(BCMA)和穿膜蛋白活化物(TACI)表达水平在大多数肿瘤组织中与正常组织差异无统计学意义(P>0.05);APRIL在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中表达水平显著高于正常黏膜(P<0.05),APRIL在胃癌组织中表达水平显著高于肠上皮化生和异型增生(P<0.05),而其受体BCMA和TACI在各组胃黏膜病变之间表达水平无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;APRIL在肿瘤发生、发展过程中可能起了重要作用;除了BCMA和TACI外,肿瘤细胞可能还存在APRIL未知受体;APRIL在某些类型肿瘤有可能主要是通过受体BCMA而不是TACI发挥作用。     

胃癌患者细胞间黏附分子-1表达意义的研究

目的 :研究胃癌瘤体细胞间黏附分子 - 1(intercellularadhesionmolecule- 1,ICAM - 1)的表达与胃癌临床病理特征及其侵袭转移的关系。方法 :采用免疫组化技术 (S -P法 )对 6 0例胃癌及 15例远癌胃组织标本中ICAM - 1进行检测 ,分析ICAM - 1的表达与胃癌临床病理之间的关系。结果 :胃癌和远癌胃组织中ICAM - 1的阳性表达率分别为70 % (42 / 6 0 )和 2 0 % (3/ 15 ) ,两者之间差异有显著性 (P <0 .0 1) ,组织ICAM - 1表达水平与胃癌淋巴结转移、TNM分期密切相关。结论 :检测胃癌组织ICAM - 1的表达水平对评估淋巴结转移程度、TNM分期及胃癌侵袭深度有较大意义 ,ICAM - 1可能是反映胃癌侵袭转移潜能的一个有效生物学指标     

细胞间粘附分子-1在胃癌中的临床意义

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一.     

内镜下氩离子凝固术治疗成熟型疣状胃炎30例分析

目的 探讨内镜下氩离子凝固术(APC)对成熟型疣状胃炎的治疗价值及其安全性。方法 选择我院消化内镜中心经内镜和病理组织学检查确诊的30例成熟型疣状胃炎，行内镜下氩离子凝固治疗，直至疣状病灶灼除后黏膜平坦或略凹、病灶表面泛白或泛黄为止。1个月后行内镜复查和临床随访。结果 30例53枚疣状病灶均全部灼除，凝固次数依病灶大小而定。1个月后随访，28例患者临床症状消失，内镜下疣状病灶平伏，胃黏膜炎症明显改善，2例临床症状好转，内镜下疣状病灶基本平伏，胃黏膜炎症改善。少数病例有腹胀和腹部隐痛，无出血、穿孔等并发症。结论 内镜下APC治疗成熟型疣状胃炎是一种简单、有效、安全的热效应方法，有一定的临床推广价值。     

RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、由特异性引起的转录后基因沉默现象. RNA干扰技术作为基因沉默的有效手段,在肿瘤治疗方面显示出良好的前景.现就RNA干扰的机制、双链RNA的设计、小干扰RNA(siRNA)的制备方法和RNA干扰技术在胰腺癌治疗研究中的应用进展作一综述.