利用甲胎蛋白启动子活力筛选人胚胎肝脏前体细胞

目的 利用甲胎蛋白启动子活力筛选人胚肝脏前体细胞克隆。 方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将甲胎蛋白启动子片段构建于pGL3载体中并测序鉴定,将其与pRL-TK质粒共转染到HepG2、A549和HeLa细胞中,通过相对荧光素酶活力分析甲胎蛋白启动子活力的特异性。采用克隆化培养法获得人胚胎肝脏细胞克隆,检测各克隆的甲胎蛋白启动子活力,并应用间接免疫荧光染色方法检测甲胎蛋白表达情况。 结果 经PCR、酶切分析及DNA序列测定证实pGL3-AFP质粒克隆成功。将其与pRL-TK质粒共转染到表达甲胎蛋白的HepG2细胞和不表达甲胎蛋白的A549、HeLa细胞中,仅在表达甲胎蛋白的HepG2细胞中检测到了较高的甲胎蛋白启动子活力,胚胎肝脏细胞中也检测到了甲胎蛋白启动子活力,表明其中含有表达甲胎蛋白的细胞。利用克隆培养法获得5个胚胎肝脏细胞克隆,将其分别共转染pGL3-AFP和pRL-TK质粒,发现其中1个克隆的甲胎蛋白启动子活力与HepG2细胞接近,且免疫荧光染色结果显示,该克隆细胞甲胎蛋白阳性率为(99.1±0.6)%,表明此克隆为肝脏前体细胞克隆。 结论 利用甲胎蛋白启动子活力结合克隆培养法可以获得肝脏前体细胞克隆。     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

血红素加氧酶1对高糖和高脂培养的内皮细胞增殖的影响

目的探讨血红素加氧酶1（HO—1）对高浓度葡萄糖和软脂酸培养的内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法利用逆转录病毒介导的基因转染技术将HO-1基因转染入人脐静脉内皮细胞，应用Westernblot和免疫细胞化学技术检测转染细胞HO—1蛋白表达水平；应用MTT法和流式细胞术检测转染和未转染的内皮细胞增殖率和凋亡率。结果HO—1蛋白在转染内皮细胞的表达量显著升高。高糖和软脂酸培养48h后，转染细胞增殖率高于未转染细胞，但两组细胞凋亡率无差别。结论HO—1基因的表达上调可减轻高糖和高脂对内皮细胞增殖的抑制作用。     

早期反应基因Ier5启动子区辐射敏感的转录因子结合位点研究

目的 探讨辐射诱导早期反应基因5(Ier5)的转录调控机制。方法 运用缺失体构建、定点突变、电泳迁移率实验(EMSA)及染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,确定宫颈癌HeLa细胞中Ier5基因启动子区域、转录因子及其结合位点。结果 发现Ier5基因的启动子区可能在缺失体Ier5-8所包含的范围(-408~-238 bp)内。Ier5基因具有2个转录因子,分别为GCF、NFI,其中GCF的结合位点在Ier5基因启动子-388~-382 bp和-274~-270 bp处,NFI的结合位点在Ier5基因启动子-362~-357 bp处。GCF抑制Ier5基因的表达,抑制作用随γ射线吸收剂量的增加而减弱,NFI促进Ier5基因的表达。结论 Ier5基因启动子最可能的区域为-408~-238 bp,该区域存在2个辐射敏感的转录因子GCF和NFI的结合位点。GCF对Ier5基因的顺式作用元件起负调节作用,而NFI起正调节作用。     

大鼠肝刺激因子对CCl_4损伤小鼠肝脏保护作用机制的研究 Ⅱ.HSS 保护膜结构稳定性的作用

本工作用小鼠肝细胞膜、线粒体膜和微粒体膜为研究对象,观察经过生物活性鉴定过的肝生长刺激因子(HSS)对 CCl_4损伤膜流动性的效应。利用荧光探测剂 DPH 与含膜片液混合,测其荧光偏振度并计算膜的微粘度,以作为膜流动性改变的指标。结果表明,HSS 可减弱 CCl_4对肝细胞膜、线粒体膜和微粒体膜的损伤,使它们保持正常的流动性和稳定性。我们推测这可能是 HSS 保护肝脏的机制之一。     

CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达

目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.     

在原核细胞中重组人肝刺激因子的表达、纯化及其功能研究

目的肝刺激因子（hepatic stimulator substance, HSS）在肝细胞中含量甚微、纯化困难,至今未分离到理想的生化纯品.利用DNA重组技术,进行人肝刺激因子（human HSS, hHSS）基因原核表达研究.方法 hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,定向插入至pT7-7载体相应位点.转化感受态细菌DH5α,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因.再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21（DE3）中,以IPTG诱导hHSS表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白,经蛋白印迹杂交及蛋白质肽指纹图谱分析鉴定hHSS.重组hHSS作用于BEL-7402细胞,利用MTT法检测其促增殖作用.结果 pT7-7-hHSS正确地表达了hHSS,纯化的rhHSS具促增殖作用,并呈现剂量-效应关系.结论通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS,且具有生物学活性.     

甲亢合并低钾性周期麻痹的观察及护理

因甲亢引起低钾性周期麻痹(以下称周麻),症状发生快,且病情进展迅速,如不及时抢救可死于阿斯综合征或呼吸肌麻痹,所以应高度重视。据国内统计甲亢伴周麻的占3％左右,而我科自1985年以来共发生过51例,约占甲亢病人的6.8％。一、病因 (一)钾的代谢异常:临床上发现部分甲亢患者钾代谢异常。我科曾遇1病例,先出现高血压、高醛固酮、低肾素、低血钾(2.9mmol/L),经常双下肢软瘫,有时摔倒,诊断为原发性醛固酮增多     

单味溪黄草对小鼠移植性腹水型肝癌的防治效果观察

目的　探讨单味溪黄草水煎剂对小鼠移植性腹水型肝癌 (H2 2 )细胞防治效果。方法　将实验小鼠除正常对照组皮下注射生理盐水外 ,其它各组皮下移植H2 2 细胞后 ,预防组小鼠饮用溪黄草水煎剂 ,治疗组小鼠 4d后待有肿物形成时饮服溪黄草水煎剂 ,以观察小鼠生瘤率、死亡率、瘤体重量及淋巴和肺组织转移情况。结果　实验各组除正常对照组外小鼠生瘤率 10 0 .0 % ,预防和治疗组的瘤重和死亡率与模型对照组比较均有增加 ,肺转移明显 ,但未见淋巴转移。结论　单味溪黄草水煎剂不能抑制H2 2 细胞生长 ,对经血循环转移至肺有激发加强作用