CCK-8通过调节κB活性促进大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6转录

目的观察硫酸化八肽胆囊收缩素(sCCK-8)对TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6基因表达的影响及核因子NF-κB活性,以探讨CCK-8对类风湿性关节炎(RA)的调控机制。方法大鼠滑膜细胞株RSC-364经TNF-α、sC-CK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3 h,用RT-PCR检测细胞IL-6 mRNA的表达,孵育1 h,用电泳迁移率检测NF-κB活性,孵育30 min,用Western blot检测胞浆I-κB蛋白表达。结果sCCK-8(10-8~10-6mol/L)明显增加TNF-α诱导的IL-6 mRNA表达及NF-κB活性,呈剂量依赖性,降低胞浆中I-κB蛋白水平,并可被丙谷胺所拮抗。结论sCCK-8在类风湿性关节炎(RA)发病过程中可能具有调控作用。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导ECV-304一氧化氮合酶表达的分子抑制作用

目的 探讨CCK-8抑制LPS诱导ECV-304 iNOS表达的分子机制.方法 培养ECV-304,用溶剂、CCK-8、LPS及CCK受体拮抗剂丙谷胺分别或联合孵育细胞,用Western blot检测iNOS蛋白表达,用免疫细胞化学方法检测NF-κB P65蛋白表达与核移位,用RT-PCR检测CCK-AR和CCK-BR mRNA表达.结果 ①溶剂对照组ECV-304 iNOS蛋白呈低表达;LPS诱导iNOS表达明显上调,CCK-8剂量依赖性抑制LPS的作用,单独CCK-8对其无影响.②ECV-304存在CCK-AR和CCK-BR mRNA表达,其中CCK-BR mRNA表达稍强.LPS可诱导CCK-AR和CCK-BR mRNA表达明显增强.③溶剂对照组NF-κB P65蛋白主要分布于细胞质;LPS孵育1 h后细胞核中NF-κB P65表达明显增加,CCK-8剂量依赖性抑制LPS的作用;单独CCK-8对其无影响.④丙谷胺可翻转CCK-8的抑制作用.结论 ECV-304存在CCK-AR和CCK-BR mRNA表达;CCK受体和NF-κB参与介导CCK-8抑制LPS诱导ECV-304 iNOS蛋白表达上调.     

内毒素注入致PAH过程中兔肺组织iNOS基因表达的原位检测

内毒素注入致ＰＡＨ过程中兔肺组织ｉＮＯＳ基因表达的原位检测河北医科大学病理生理教研室（石家庄０５００１７）万梅凌亦凌河北医科大学分子生物学研究室王俊霞丛斌实验应用免疫组化、原位杂交和原位ＰＣＲ技术检测了ＬＰＳ静脉注入后１ｈ和５ｈ兔肺组织ｉＮＯＳ蛋白和...     

CCK-8对内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及协同刺激功能的影响

目的： 探讨八肽胆囊收缩素（CCK-8）对内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激活性的影响。方法: 将BALB/c小鼠随机分组（n=4）,分别腹腔注射生理盐水（0.2-0.3 mL/mouse），LPS（100 μg/mouse）和/或CCK-8 (5 nmol/mouse)及CR1409（100 μg/mouse）、CR2945（100 μg/mouse）。12 h后收集并纯化腹腔巨噬细胞。采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化。用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4+T细胞，按4∶1数量比与上述处理的腹腔巨噬细胞共同体外培养，同时加入ConA 5 mg/L，采用［³H］掺入法测定CD4+T细胞增殖，反映巨噬细胞的协同刺激活性。结果: 整体应用CCK-8作用小鼠腹腔巨噬细胞，与对照组相比，CCK-8可上调静息小鼠腹腔巨噬细胞B7.2的表达，而对B7.1的表达则无影响；并且CCK-8使CD4+T细胞［³H］-TdR的掺入率升高，即促进其增殖，增强巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8降低LPS活化的内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达并且降低CD4+T细胞的［³H］-TdR掺入率，即抑制其增殖，抑制其协同刺激活性。CR1409及CR2945均能逆转CCK-8的上述作用，且CR1409的作用较CR2945更明显。结论: CCK-8通过上调巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性；并且降低LPS活化的内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达，抑制其协同刺激活性。该作用由CCK1R及CCK2R共同介导，其中CCK1R起主要介导作用。     

八肽胆囊收缩素对内毒素血症大鼠CD14表达的抑制作用

目的CD14是宿主识别细菌脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)的关键受体,以膜结合型(membrane-associatedCD14,mCD14)和可溶性(solubleCD14,sCD14)两种形式存在.CD14结合LPS的脂质A介导信号传递,诱生大量炎症介质.而LPS又可直接或间接上调CD14的表达,促进炎症反应,最终引起多器官衰竭.应用CD14抗体可明显减轻细胞对LPS的反应,提高内毒素血症家兔的生存率.目前CD14已成为治疗内毒素休克的新靶子.我们以往的研究表明八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)具有明显的抗内毒素休克(endotoxicshock,ES)作用,可减轻ES大鼠肺、肝、肾组织炎症反应,降低肺动脉压,提高平均动脉压,改善生存率,但其作用机制尚未完全阐明.为深入探讨CCK-8抗ES作用的机制,本研究观察了CCK-8对内毒素血症大鼠肺组织及血清中CD14蛋白表达的影响.方法静脉注入LPS(5mg/kgdw)6h复制大鼠内毒素血症模型,用Westernblot技术检测血清中sCD14蛋白的表达,用免疫组织化学技术检测肺组织中CD14的表达及分布.静脉预注入CCK-8(40μg/kgdw)和/或CCK受体拮抗剂丙谷胺(1mg/kgdw)10min后注入LPS6h,观察上述指标.结果(1)大鼠血清中sCD14蛋白存在两种分子形式sCD14α(49kD)及sCD14β(55kD),注入LPS后6h二者表达均明显增加,静脉预注入CCK-8则可显著抑制其表达,且该作用可被丙谷胺拮抗;(2)对照组大鼠肺组织CD14只表达在巨噬细胞,而在内毒素血症大鼠肺组织中,不仅巨噬细胞上的CD14阳性信号增强,表达CD14的巨噬细胞增多,而且在支气管上皮细胞表面也检测到CD14阳性信号;静脉预注入CCK-8则明显减少了CD14的表达,丙谷胺可拮抗CCK-8的作用.结论CCK-8对内毒素血症大鼠肺组织CD14及血清sCD14的表达具有抑制作用,降低大鼠对LPS的敏感性,可能是CCK-8抗ES作用的重要机制之一.     

三态MVR-PCR方法检测中国汉族人群D2S44(YNH24)基因座3'端遗传多态性

目的 揭示中国汉族人群（河北）D2S44基因座3′端的遗传多态性。方法 采用三态MVR-PCR和变性PAGE-银染技术对D2S44基因座进行检测，结果用数字编码表示。结果 在被检116名无关个体中，每一个体平均得到11个数字编码，未发现任何两个无关个体所有编码相同，三种重复单位出现的频率分别为：Ⅰ型：34.33%，Ⅱ型：33.52%，Ⅲ型：21.63%，0型：10.51%。在116名无关个体中，两个无关个体拥有相同的编码概率为0.1365，所有个体11个编码均相同的概率为3.06×10-10，杂合度为0.9755，多态信息含量为0.9751，非父排除率为0.9510。结论D2S44基因座在中国汉族人群（河北）中具有很高的遗传多态性，在人类群体遗传学及法医学研究领域有重要应用价值。     

细胞因子诱导的蛋白质巯基亚硝基化对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞中CREB蛋白的DNA结合活性的影响

目的:观察重组白细胞介素-1β(rIL-1β)和重组干扰素-γ(rIFN-γ)联合诱导的亚硝基化反应对cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的DNA结合活性的影响。方法:(1)分别用细胞因子(rIL-1β和rIFN-γ的混合物)、诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍(AG)及溶剂单独或联合孵育大鼠滑膜细胞12h,收集培养液上清进行一氧化氮(NO)含量测定;并提取各组总蛋白,其中细胞因子组的蛋白与巯基氧化修饰还原剂二硫苏糖醇(DTT)反应15min,采用生物素转化法与免疫印迹技术检测各组蛋白质的亚硝基化修饰水平。(2)分别用rIL-1β、rIL-1β和rIFN-γ的混合物、AG及溶剂单独或联合孵育滑膜细胞12h,提取各组核蛋白,其中rIL-1β+rIFN-γ组核蛋白与DTT反应15min,采用电泳迁移率改变分析技术观察各组CREB的DNA结合活性。结果:(1)细胞经rIL-1β和rIFN-γ孵育后,NO生成增多(P0.01),蛋白质的亚硝基化修饰水平升高,而AG降低了NO的水平(P0.01)并抑制了亚硝基化反应,DTT与总蛋白直接作用也可抑制亚硝基化反应。(2)rIL-1β和rIFN-γ共孵育明显抑制rIL-1β单独诱导的CREB的DNA结合活性(P0.01),而AG抑制了rIL-1β和rIFN-γ的作用,DTT与核蛋白直接反应也可逆转细胞因子共孵育的作用,使CREB的DNA结合活性增高(P0.01)。结论:IL-1β和IFN-γ共同孵育滑膜细胞可诱导细胞适度产生NO,使细胞内蛋白质的亚硝基化修饰水平升高,导致CREB发生可逆性巯基氧化修饰,抑制其DNA结合活性。     

过氧亚硝基阴离子参与介导内毒素所致急性肺损伤的研究

目的 探讨过氧亚硝基阴离子（ＯＮＯＯ＾－）在脂多糖（ＬＰＳ）所致急性肺损伤中的作用。方法 用免疫组织化学技术检测内毒素休克时ＯＮＯＯ＾－生成的标志物硝基酷氨酸在大鼠肺脏内的定位与分布。将不同剂量的外源性ＯＮＯＯ＾－经气管快速推注入健康大鼠肺脏，定量检测肺系数、肺湿干重比、肺水含量和伊文思蓝含量，光镜观察单层蓝标记肺微血管数量及病理变化。结果 ＬＰＳ静脉注射２ｈ和６ｈ后，肺脏有明显损伤及硝基酷氨酸产     

河北汉族人群miniSTR D17S974 、D11S4463基因座复合扩增及遗传多态性研究

在法医DNA检验中,短串联重复序列(shorttandem repeat,STR)技术已经广泛用于个人识别和亲子鉴定。但对于法医检验中一些微量以及降解的检材,因STR技术扩增片段较长(约300~400 bp)不能成功得出结论,会出现“优势扩增”或者“无效扩增”;而miniSTR分析技术是将引物设计得尽可能靠     

过氧亚硝基阴离子致大鼠肺微血管壁通透性增高的研究

目的:探讨过氧亚硝基阴离子(ONOO^-)对肺微血管内皮屏障功能的影响和在急性肺损伤发生中的意义。方法:向SD大鼠气管内推注不同浓度的ONOO^-、分解 ONOO^-或溶剂2 h后,检测肺微血管壁通透性变化和肺组织病理学变化,并检测ONOO^-引起正常肺匀浆MDA含量变化。结果: ONOO^-推入气管后,肺系数、肺湿干重比以及肺含水量和伊文思兰含量明显增高呈现剂量效应关系;并可导致肺泡明显萎陷、肺泡壁毛细血管明显扩张充血及局灶性出血,内皮细胞肿胀、核深染及脱落。ONOO^-造成正常肺匀浆MDA含量增加。 结论: 外源性ONOO^-气管推注后可导致明显的肺微血管内皮屏障功能障碍,提示肺内源性ONOO^-生成增多时可能参与介导急性肺损伤的发生。