人骨形成蛋白2，3成熟肽削短／突变体的表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白 [1 ] (bone morphogenetic proteins,BMPs)是属于 TGF-β超家族的成员 ,目前已有 18个 h BMP基因被克隆 .除 BMP- 1外 ,其他 BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用 [2 - 4 ] ,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景 .利用 E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性 [5 ,6 ] ,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系 ,尚未见报道 .在上述工作的基础上 ,本研究在大肠杆菌中表达削…     

基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞的生物学效应

目的 骨髓是机体重要的造血器官,其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞,骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用,为提高骨形成蛋白（ＢＭＰ）修复骨缺损的能力。方法 本实验观察了基因重组人骨形成蛋白－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ－２,ｒｈＢＭＰ２）对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结果 低浓度的ｒｈＭＢＰ２）对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结     

简化提取核心蛋白聚糖的方法及扩大活性检测范围

目的简化分离、纯化核心蛋白聚糖的程序 ,了解其对瘤细胞生长的抑制作用。方法经匀浆、溶解沉淀、透析、研磨等步骤制备核心蛋白聚糖 ,MTT染料结合法检测A5 49、BT32 5等四种癌细胞体外生物学活性。结果简化法制备的核心蛋白聚糖得率为 3mg/g大鼠肌肉 ,SDS PAGE显示在相对分子质量 36～ 38kD间有两条带 ,除明显抑制A5 49生长外 ,对Hela、胃 790 1及BT32 5三者同样具有抑制生长活性 ,抑制率依次为 6 9.19%、48.19%、5 4.47%、6 7.80 %。结论此法成本低、纯度好、收获量及生物学活性略有提     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

联合使用骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞成骨表型的影响

目的研究联合使用骨形态发生蛋白(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成纤维细胞成骨表型的影响。方法向培养的成纤维细胞NIH3T3中加入不同浓度的rhBMP-2和bFGF,观察成纤维细胞形态学变化、碱性磷酸酶(ALP)活性与染色的情况和骨钙素表达的变化,同时观察细胞增殖周期的变化。结果在两种因子作用下,成纤维细胞由长梭形向多角形方向转化,细胞体积增大、细胞内颗粒增多;成纤维细胞ALP活性增高、骨钙素表达增多,细胞内ALP染色加深;细胞增殖周期缩短。结论联合使用rhBMP-2和bFGF可以促进成纤维细胞成骨表型表达并促进细胞增殖。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

用消减杂交技术克隆人成骨样细胞机械牵张力敏感基因的研究

目的　对人成骨样细胞机械牵张力敏感基因进行克隆研究。方法　对人成骨样细胞Saos-2进行二维方向上的加载,变形幅度为12%,牵拉频率为6周期/分钟,加载12 h后分别提取牵张力作用后Saos-2细胞及未作处理的正常Saos-2对照细胞的mRNA,反转录制备cDNA,将cDNA进行消减杂交,构建加载细胞与未加载细胞的差异表达基因的扣除cDNA文库,克隆后进行序列测定。结果　克隆到的基因片段中,功能已知基因片段15个,功能未知基因片段2个,其中牵张力敏感基因1(SSG1)位于9号染色体上,功能未知;牵张力敏感基因2(SSG2)位于18号染色体上,与转录因子2,4高度同源。结论　用消减杂交技术可以对人成骨细胞样机械牵张力敏感基因进行有效的克隆研究。     

Reciprocal action between BMP-2 and BMP-3 in cultured fibroblast in vitro

Objective:To explore reciprocal action between BMP-2 (bone morphogenetic protein-2)and BMP-3 for better understanding of the mechanism of BMP during bone fracture union.Methods:rhBMB-2 was added into the cultured fibroblasts with the concentration of 1200 ng/ml.The expression of BMP-3 in fibroblasts was detected by immunohistochemistry.Eukaryotic expression vector pcDNA3-BMP-3 was transfected into the fibroblasts.After the effective expression of BMP-3 was identified,BMP-2 was also detected by immunohistochemistry in BMP-3 expression cells.The fibroblasts transfected with empty vector pcDNA3 were used as the control.Results:Exogenous rhBMP-2 could promote the expression of BMP-3 in fibroblasts. BMP-3 also could be detected in these cells.Conclusions:BMP-2 and BMP-3 could reciprocally adjust the expression in fibroblasts.     

三种抗人TNF-α重组抗体的重折叠

目的 探讨重组抗体蛋白的复性规律。方法 用共溶剂氧化还原、表面活性剂介导、变性剂介导及抗原介导复性四种条件对抗人TNF－α单域抗体、单链抗体GST融合蛋白进行了分离纯化。结果 复性产物的可溶率为10％左右。结论 几种复性方法均可使目的蛋白复性，抗原的诱导和色谱法复性的复性效率较高。     

人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库的构建

目的 :构建人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库。方法 :对培养的人成骨样细胞Saos -2进行二维方向上的加载 ,细胞平均变形幅度为 12 % ,牵拉频率为 12次 /min ,加载 12h后提取应力作用后细胞及正常对照组细胞的mRNA ,制备各自的cDNA ,用基于PCR的消减杂交技术构建人成骨样细胞机械牵拉力作用下差异表达基因文库 ,即机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库 ,并进行初步的序列测定。结果 :成功地构建出人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA文库 ,库容量约为 2 0 0 ;初步的测序结果表明文库内的基因多与应力作用下细胞发生的生物学变化有关 ,并成功地得到一个新的基因片段。结论 :用基于PCR的消减杂交技术可以有效构建人成骨细胞样机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库