人成釉蛋白C端肽的大量表达及纯化

目的:获得高纯度的重组人成釉蛋白C端肽。方法:实验于2001-01/2004-06在解放军第四军医大学口腔内科实验室解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学实验室完成。①转化pRSET-A/成釉蛋白原核表达质粒入BL21(DE3)细菌进行大量培养,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,32℃继续振荡诱导培养5h,收集细菌,诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱Ni-NTA结合蛋白,收集洗脱蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。②离子交换层析缓冲液(pH 7.4,50 mmol/L Tris·Cl)平衡Q SapharoseHP层析柱,将初步纯化的蛋白样品加在Q Sapharose HP凝胶介质上,梯度洗脱结合的蛋白,收集洗脱峰,制样,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白。结果:①表达重组人成釉蛋白C端肽的金属螯合亲和层析结果:诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱下Ni-NTA结合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳证实获得初步纯化的重组人成釉蛋白C端肽,其中仍含一些杂蛋白。②重组人成釉蛋白C端肽的离子交换层析结果:获得多个蛋白洗脱峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组人成釉蛋白C端肽。结论:获得了纯化的人成釉蛋白重组蛋白。     

携载rhBMP-2微球的新型复合人工骨的释药及成骨活性研究

目的 制备一种具有良好降解性和成骨活性，可注射的自凝固新型骨修复材料。方法制备携载rhBMP-2的聚乳酸与聚乙醇酸共聚物（PLGA）微球，并将其与rhBMP-2／磷酸钙骨水泥（CPC）复合。制备出rhBMP-2／PLGA微球／CPC复合人工骨。测定了复合材料释药速度，将复合材料及rhBMP-2-CPC分别植入兔双侧股骨髁骨缺损区域，通过X线、组织学观察比较不同时期材料的降解及成骨情况。结果 复合材料各时间点的体外释药量均大于单纯rhBMP-2／CPC组．与单纯rhBMP-2／CPC材料相比较，复合材料植入体内后不同时间点材料的降解和新骨生成均高于单纯rhBMP-2／CPC植入组。结论 rhBMP-2／PLGA微球的掺入可明显加快rhBMP-2的释放。提高材料的降解速度和成骨活性。     

人牙周膜成纤维细胞与牙龈成纤维细胞差异表达一条新基因的克隆

目的：克隆人牙周膜成纤维细胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＰＤＬＦ）与牙龈成纤维细胞（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＧＦ）差异表达的新基因。方法：采用基于ＰＣＲ和消减杂交的基因克隆技术构建体外培养的人ＰＤＬＦ与ＧＦ差异表达基因的扣除文库,采用酶切和反向杂交的方法筛选目的的克隆,并进行测序和计算机分析。结果：从构建的人ＰＤＬＦ与ＧＦ细胞差异表达基因的扣除     

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

人防御素-α克隆表达纯化及生物活性初步检测

防御素（Defensin）是一类阳离子大环形多肽,在人体多种器官和组织广泛存在,起着重要的屏障防御作用,对G＋/-菌、真菌及病毒都有杀灭作用.临床观察表明,测定血浆及各种体液中防御素的改变有助于某些炎症性疾患的诊断,如脓毒症、细菌感染及早产等.此外,提纯或重组防御素作为“超级抗生素”来取代传统的抗生素已成为药学界的研究热点.本研究拟在大肠杆菌中表达人防御素-α,建立稳定表达的工程菌和纯化、复性技术途径,获得活性蛋白,为进一步研究提供材料.     

联合使用骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞成骨表型的影响

目的研究联合使用骨形态发生蛋白(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成纤维细胞成骨表型的影响。方法向培养的成纤维细胞NIH3T3中加入不同浓度的rhBMP-2和bFGF,观察成纤维细胞形态学变化、碱性磷酸酶(ALP)活性与染色的情况和骨钙素表达的变化,同时观察细胞增殖周期的变化。结果在两种因子作用下,成纤维细胞由长梭形向多角形方向转化,细胞体积增大、细胞内颗粒增多;成纤维细胞ALP活性增高、骨钙素表达增多,细胞内ALP染色加深;细胞增殖周期缩短。结论联合使用rhBMP-2和bFGF可以促进成纤维细胞成骨表型表达并促进细胞增殖。     

简化提取核心蛋白聚糖的方法及扩大活性检测范围

目的简化分离、纯化核心蛋白聚糖的程序 ,了解其对瘤细胞生长的抑制作用。方法经匀浆、溶解沉淀、透析、研磨等步骤制备核心蛋白聚糖 ,MTT染料结合法检测A5 49、BT32 5等四种癌细胞体外生物学活性。结果简化法制备的核心蛋白聚糖得率为 3mg/g大鼠肌肉 ,SDS PAGE显示在相对分子质量 36～ 38kD间有两条带 ,除明显抑制A5 49生长外 ,对Hela、胃 790 1及BT32 5三者同样具有抑制生长活性 ,抑制率依次为 6 9.19%、48.19%、5 4.47%、6 7.80 %。结论此法成本低、纯度好、收获量及生物学活性略有提     

自拟桔梗蜈蚣散配合穴位敷贴对咳嗽变异型哮喘缓解期的治疗作用

正咳嗽变异型哮喘(cough variant asthma,CVA)是以慢性咳嗽为主要或唯一表现的特殊类型哮喘[1],并常反复发作。CVA缓解期的治疗对防止或减少急性发作有重要作用。笔者运用自拟桔梗蜈蚣散配合穴位敷贴治疗CVA缓解期疗效显著,现报道如下。1临床资料1.1一般资料154例均为2005年9月-2011年9月天水市第四人民医院呼吸科门诊患者。按门诊顺序号随机分为3组。治疗组52例,其中男28例,女24例;年龄16~69岁,平均(46.3±7.8)岁;病程65~131 d,平均(112.67±28.12)d。     

用消减杂交技术克隆人成骨样细胞机械牵张力敏感基因的研究

目的 :对人成骨样细胞机械牵张力敏感基因进行克隆研究。方法 :对人成骨样细胞Saos 2进行二维方向上的加载 ,变形幅度为 12 % ,牵拉频率为 6周 /分钟 ,加载 12小时后分别提取牵张力作用后Saos 2细胞及未作处理的正常Saos 2对照细胞的mR NA ,反转录制备cDNA ,将cDNA进行消减杂交 ,构建加载细胞与未加载细胞的差异表达基因的扣除cDNA文库 ,克隆后进行序列测定。结果 :克隆到的基因片段中 ,功能已知基因片段 15个 ,功能未知基因片段 2个 ,其中牵张力敏感基因 (SSG1)位于 9号染色体上 ,功能未知 ;牵张力敏感基因 (SSG2 )位于 18号染色体上 ,与转录因子 2 ,4高度同源。结论 :用消减杂交技术可以对人成骨细胞样机械牵张力敏感基因进行有效的克隆研究。