多媒体数字化系统在细胞生物技术研究中的应用

目的 在细胞生物学研究中，利用先进的多媒体技术对传统的图像资料采集方法进行改革，提高资料采集、储存和保管的质量。方法 实验于2002-02／2004-05在解放军总医院全军骨科研究所完成。利用计算机、数码照相机、扫描仪、刻录仪、计算机图像采集系统、彩色激光打印机及各种软件收集和再现各方面的信息资料，按研究目的制作不同数据库及多媒体文件，建立影像资料库，简化资料的处理过程。结果 2002-02起建立细胞生物学多媒体数字化系统，截至2004-05，累计采集图像16万张，相关资料容量60G。结论 此套系统效率高，成本低，技术易掌握，资料分类、保存、查找容易，便于医学科研工作。     

柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及生物相容性评价

目的：以二水硫酸钙为原料，制备出高纯度柠檬酸化半水硫酸钙，并对其生物相容性进行评价。方法：实验于2004-09／2005-01在解放军总医院骨科研究所完成。柠檬酸化半水硫酸钙粉沫是粉状的二水硫酸钙经特殊处理制得。根据文献对实验材料进行生物相容性及安全性评价实验。①红细胞溶解性：材料粉末制备的浸提液加入抗凝兔血内恒温水浴60min、离心取上清液，分光光度计测定上清液吸光度。计算红细胞溶血率（％）=（实验组吸光度-阴性对照组吸光度）／（阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度）&;#215;100％、标准：≤5％为正常。②细胞毒性试验：采用四甲基偶氮唑盐比色法。兔骨髓基质干细胞经复苏、传代、培养24h后进行更换含材料浸提液的培养基继续培养、酶标仪测定1，3，5，7d吸光度。计算细胞相对增值率=实验组吸光度／对照组吸光度。③细胞材料表面贴附：骨髓基质干细胞细胞悬液滴在材料表面，培养3d后，倒置显微镜下观察材料边缘细胞生长情况。乙醇固定后用环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况。④热源性：自体温试验筛选合格新西兰家兔的耳缘静脉注入材料浸提液后，定时测兔体温。标准：每只体温升高在0．6℃以下，3只体温升高总度数小于1．4℃。⑤皮肤刺激性：健康新西兰家兔脊柱两侧选点注射材料花生油及DMEM浸提液，每个点注射0．2mL。观察注射部位皮肤反应。⑥致敏性：将浸提液与完全氟氏佐剂完全乳化制成相应剂型试剂，以豚鼠为观察对象，观察腹部激发部位皮肤反应。结果：①材料特性：制备材料2h固化抗压缩强度达到26MPa，初凝时间5rain，终凝时间20min。扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构。②细胞粘附与生长形态：骨髓基质干细胞在材料周围生长．环境扫描电镜观察细胞贴附材料表面生长，呈不规则的梭形、多角形，胞体伸出伪足长短不等。③红细胞溶解实验：红细胞溶血率为0．34％，远小于阳性标准，说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应。④热源反应：家兔平均体温升高为0．1℃，符合医用材料的热源反应要求，说明本材料本身不具有致热源作用。⑤皮内注射：两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑及水肿反应，提示材料对动物机体没有刺激性。⑥致敏实验：致敏率为0，与阴性对照没有差别，说明材料没有致敏性。⑦细胞毒性实验的检测结果提示实验组细胞相对增值率和对照组无显著性差别，评分为0～1级，说明材料本身不具有细胞毒性。结论：生物安全性评价结果初步显示制备的材料具有良好的生物相容性，符合医用生物材料的基本要求。     

原位定量评价组织工程研究中细胞生长状态的新方法

目的探讨一种能原位定量评定细胞在高分子聚合物载体上生长情况的方法。方法采用CFDA-AM和PI双染结合激光扫描共聚焦显微镜技术,用平均荧光强度代表细胞数量,对组织工程骺软骨中骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上1、2及3周时的死活细胞数量进行评价。结果骨骺软骨细胞在聚乳酸载体上的530nm的平均荧光强度随时间逐渐增加,而603nm的荧光强度在第2周时有所增加,而到第3周时则无明显增加。与细胞在载体上重量增加的结果一致。结论首次采用的原位定量检测载体上死活细胞的方法是可行的,解决了在不透明载体上即不影响细胞和载体结构,而可以原位快速定量评定细胞生长的难题。     

肌腱玻璃化法冷冻保存的体外实验

目的:目前临床上常用低温冷冻法来保存同种异体肌腱,但操作较复杂费时,并且所保存的肌腱活性较低而限制其应用。采用已筛选的玻璃化法冷冻保存鸡屈趾深肌腱,并将复温后的玻璃化肌腱进行体外检测,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成。①实验材料及分组:来亨鸡16只,雄性,体质量2.5kg左右,随机分为2组,玻璃化组为玻璃化肌腱,新鲜肌腱组为新鲜肌腱,每组8只。②实验过程:切取来亨鸡屈趾深肌腱,置入玻璃化液内快速投入液氮保存2周制备玻璃化肌腱。③实验评估:将2组肌腱在体外进行大体、组织学及超微结构观察,羟脯氨酸含量测定,生物力学性能检测,并对两组肌腱进行细胞培养与鉴定。结果:①玻璃化组肌腱的大体、组织学及超微结构与新鲜肌腱组相似,其细胞及细胞外结构得以良好保存。②应用碱解法测定玻璃化肌腱内的羟脯氨酸含量为69.27mg/g,与新鲜肌腱组间差异无统计学意义。③玻璃化组肌腱破裂强度为165.58MPa,弹性模量1.41GPa,与新鲜肌腱组的力学性能差异无统计学意义。④将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,其生物学特性与新鲜肌腱组相似。⑤将两组肌腱培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞。结论:玻璃化法保存的肌腱具有良好的细胞活性、细胞外结构及力学性能,其生物学及生物力学特性无明显变异。     

取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞生物学行为的影响

目的：观察取向性关节软骨细胞外基质源性支架对负载软骨细胞的黏附、增殖、分布及排列的影响。方法：利用定向结晶及冷冻干燥技术制备猪关节软骨细胞外基质源性取向支架。分离、培养犬关节软骨细胞,接种在支架上体外培养,CCK-8试剂盒检测细胞在支架上的黏附和增殖,倒置显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及H＆E染色观察软骨细胞在支架上的形态、分布和排列情况,并以接种在非取向支架上的软骨细胞的生物学特性作为对照。结果：软骨细胞在两种支架上均能较好的黏附生长,大部分细胞呈圆球形;但在取向支架上增殖比在非取向支架上快（P〈0.05）;并且在取向性支架上软骨细胞能沿着支架孔道的取向性生长,在支架内部分布均匀,类似天然软骨组织的柱状结构;而在非取向性支架内软骨细胞呈无序排列,分布不均匀,支架内部细胞数量较少。结论：取向性软骨细胞外基质源性支架利于软骨细胞黏附、增殖,能引导软骨细胞分布排列呈类似于天然软骨细胞的柱状排列方式,是一种较理想的软骨组织工程支架。     

骨局部植入型硫酸钙/庆大霉素释放系统的生物相容性

背景：国外商品化的硫酸钙产品尽管临床应用效果较好，但存在依赖进口和价格较高的缺陷。 目的：自行构建骨植入型硫酸钙/庆大霉素药物释放系统，并评价其生物相容性。 设计、时间及地点：观察对比实验，于2005-10/2006-09在解放军总医院骨科研究所完成。 材料：以自制柠檬酸化半水硫酸钙为庆大霉素的载药基质，制备硫酸钙/庆大霉素植入剂抗生素含量5%。 方法：根据医疗器械生物学评价实验选择指南（ISO标准10993-1，1997）和国家标准GB/T16886-1选择红细胞溶血实验、细胞毒性实验、热原实验、肌肉内植入实验及骨内植入实验评价硫酸钙/庆大霉素抗生素释放系统的生物相容性。 主要观察指标：红细胞溶血率、细胞相对增殖率、体温升高情况及组织相容性。 结果：①抗生素释放系统红细胞溶血率为2.02%，小于阳性标准。②细胞毒性实验：实验组细胞相对增殖率和对照组无显著性差别，毒性评分为0~1级。③热原反应：家兔平均体温升高为0.3 ℃，符合医用材料的热源反应要求。④肌肉内植入实验：抗生素释放系统在肌肉组织内可逐渐降解，材料周围未见大量炎性细胞浸润，组织无排斥。⑤骨内植入实验：骨组织内抗生素释放系统可逐步降解，并逐渐被骨性组织替代，无排斥现象及肝肾毒性。 结论：构建的硫酸钙/庆大霉素释放系统不会引起机体本身的溶血反应，不具有细胞毒性和致热源作用，可逐步降解，无排斥现象，具有良好的生物相容性和安全性。     

人关节软骨源性微载体的制备

目的制备一种既能大量扩增人软骨细胞,又能作为细胞支架的人关节软骨源性微载体.方法切取人关节软骨,冷冻干燥后粉碎,筛取150～200μm的软骨颗粒,以质量分数为0.25%的胰蛋白酶37℃消化24 h,加入体积分数为1%的Triton X-100振荡72 h,在倒置相差显微镜下进行观察,并行HE、番红花O染色及软骨蛋白聚糖、Ⅱ型胶原免疫组化染色.将微载体经60Co照射灭菌后与人关节软骨细胞共同培养.结果倒置相差显微镜下可见关节软骨颗粒冻干后呈黄色,形状不一,可呈方形、多角形或不规则形,表面凹凸不平,可见多个陷窝.经胰蛋白酶和Triton X-100处理后,微载体呈淡黄色,关节软骨的基本形态消失,微载体绒毛化,呈绒球状或毛刷状,表面接触面积大幅度增加.微载体与软骨细胞在37℃培养箱中共同培养2 h时即见大量软骨细胞黏附于关节软骨源性微载体上.HE染色显示已无软骨细胞成分;番红花O染色弱阳性,提示仍残留少许糖胺多糖;软骨蛋白聚糖免疫组化染色阴性,提示微载体内软骨蛋白聚糖已被敲除;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,提示微载体内Ⅱ型胶原仍然存留.结论经胰蛋白酶和Triton X-100处理的关节软骨颗粒,不但脱去了软骨的细胞成分、敲除了软骨蛋白聚糖、使之呈绒球状或毛刷状、增大了表面接触面积,而且保留了对软骨细胞黏附、增殖和再分化起重要作用的Ⅱ型胶原和GAG,经与人关节软骨细胞共培养,证实关节软骨源性微载体与软骨细胞的体外相容性良好.     

种子细胞库的建立及应用

目的用细胞和生物材料体外培养、体内移植,修复骨及软骨的缺损.检测新药、新材料毒性实验,需要不同类型的种子细胞.为了防止细胞老化和污染,让实验具有科学性和可重复性,特别是软骨细胞培养,建立细胞库更有必要.方法无菌取目的组织,用胶原酶、胰蛋白酶加纱巾法原代培养,建立具有增殖能力强,无污染,长期冻存,复苏成功率高的细胞系.结果自建骨、骨膜、软骨、骨髓、骺板软骨等20个细胞系.还收集了其他细胞系16个.为院内外35名研究生,98次复苏冻存细胞均获成功.结论原代培养用酶消化加纱巾法分离成功率高.22次原代培养,20次成功建系.建立种子细胞库为科研教学提供了方便.既省时,又节约经费,具有良好的应用前景.     

快中子及混合线照射人成骨肉瘤 OS-732 细胞系的实验观察

目的：观察快中子及光子对人成骨肉瘤细胞系OS-732的杀伤作用。方法：用快中子、光子及混合射线照射OS-732细胞系，检测各组细胞受照射后的集落形成率。结果：单次照射后第10天，混合线组对该细胞系集落形成的抑制作用明显弱于单中子及单光子组。结论：单次照射后第10天，单纯快中子及单纯光子对该细胞系集落形成的抑制作用明显强于混合线组，对临床上应用快中子治疗骨肉瘤有一定指导意义。     

LS174T细胞系电子线一次照射后存活效应：大肠癌术中照射…

作者观察了ＬＳ１７４Ｔ细胞系对不同剂量电子线照射后的细胞计数改变、死细胞率及集落形成率。结果表明：照射１０Ｇｙ以上时，肿瘤细胞数明显下降，且绝大多数为死细胞。