肿瘤患者血小板对肝癌细胞系Bel-7402增殖和多药耐药蛋白ABCC4的影响

血小板与炎性反应的发展,肿瘤的血管生成、肿瘤的转移等密切相关。多药耐药相关蛋白4（multidrug resistanceasscociated protein 4,ABCC4,MRP4）,是一种ABC（ATPbinding cassette trasporter）转运蛋白。ABCC4的高表达与肿瘤细胞的增长和恶性程度密切相关,但肿瘤患者血小板与ABCC4的相关性尚不清楚,本文拟探讨肿瘤患者的血小板对肿瘤细胞增殖和ABCC4表达的影响。     

去势抵抗性前列腺癌差异表达基因的生物信息学分析

目的:基于大数据从分子水平筛选原发性前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌的差异表达基因,探寻前列腺癌细胞从雄激素依赖到抵抗状态发展过程中的可能机制,为去势抵抗性前列腺癌的诊疗提供靶点。方法:在NCBI的公共基因芯片数据库（GEO）中下载原发性及去势抵抗性前列腺癌相关芯片数据（GSE74367、GSE66187和GSE126881）,利用limma包进行标准化和基因差异分析,接着采用clusterProfiler包分别进行GO功能和KEGG通路分析。将P＜0.05和|logFC|>2作为筛选标准,使用vennDiagram包合并基因集,找到3个芯片的共同差异基因,并利用clusterProfiler包对共同上调或下调基因进行基因集富集分析。结果:GSE74367和GSE66187中的差异基因主要与RNA分解代谢与剪接功能相关,主要富集于核糖体生物发生通路。GSE126881的差异基因主要与干扰素γ反应功能有关,主要富集表达于化学抗癌、类固醇激素生物合成以及视黄醇、细胞色素P450、抗坏血酸和醛酸的代谢过程。3个芯片的共同上调基因为SLC16A3,共同下调基因为DDX53。GSEA分析发现,SLC16A3上调时,果糖、甘露糖和磷酸戊糖代谢与细胞周期相关基因集显著上调;DDX53下调时,原发性免疫缺陷通路、趋化因子与细胞黏附分子等相关基因集下调,而磷酸戊糖途径、细胞周期和蛋白质外排等过程的相关基因集上调。结论:通过对3个去势抵抗性前列腺癌相关GEO芯片数据的生物信息学分析,我们发现SLC16A3的上调和DDX53的下调可能在原发性前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌的过程中发挥重要作用。     

PPAR-γ基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建表达细胞转录因子PPARγ的RNA干扰（RNAi）质粒,为研究PPARγ参与的细胞信号通路以及PPAR吖为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNA干扰质粒。方法选取PPARγ基因的19nt特异性序列,设计针对PPARγ的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer1．0-U6表达载体中,用EcoRI、ApaI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将包含PPARγ基因的RNAi重组载体转染前列腺癌细胞Pc．3。转染48h后,收集细胞裂解液,Westem blotting分析对照组与转染组PPARγ蛋白的表达水平。结果双酶切证实shRNA正确插入pSilencer1．0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确;含PPARγ基因的RNAi载体转染前列腺癌细胞PC-3细胞成功;Western blotting结果显示,与空质粒对照组相比,转染组细胞PPARγ表达下调。结论成功构建含人PPARγ基因的RNAi载体,为研究PPARγ参与的细胞信号通路提供了稳定转染的RNA干扰质粒。同时,阻断PPARγ的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点,研究结果为以PPARγ为靶点的基因治疗提供了有利工具。     

肥胖发展为二型糖尿病潜在机制的生物信息学研究

目的 进一步理解单纯肥胖发展为二型糖尿病(T2DM)的潜在机制,探讨色素上皮衍生因子(PEDF)在该过程中的影响与作用.方法 检索获取美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库并获取人胰岛组织的基因表达芯片GSE50398数据集,筛选样本差异表达基因数据进行富集分析并筛选核心靶点,利用基因集富集分析方法进行基因本体(G...     

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF—β1基因片段的RT—PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦ－β１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性，退火，延伸共３０次循环后，可以得到ｃＤＮＡ为模板的扩增产物，实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶锭反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦ－β１４６８ｂｐ扩增产物。     

半定量RT-PCR检测少量兔血管内皮细胞中特异mRNA的表达

目的：半定量检测体外培养的少量兔血管内皮细胞中特异ｍＲＮＡ的表达。方法：用Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司的快速微量ｍＲＮＡ提纯试剂盒从兔内皮细胞中直接提取出ｍＲＮＡ,并以此为模板,用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测培养的兔血管内皮细胞中内皮素（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ的相对含量。结果：从１０＾５个兔血管内皮细胞中提取出未降解的ｍＲＮＡ,Ａ２６０／Ａ２８０〉１．８;用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术,测定出ＥＴ－     

N-cadherin对视网膜色素上皮细胞增殖及迁移侵袭的影响

【目的】为了明确神经钙黏蛋白（N-cadherin）在糖尿病视网膜病变上皮-间质转化中的作用,探讨N-cadherin对视网膜色素上皮细胞增殖、迁移及侵袭力的影响及作用机制。【方法】分别采用Ad-N-cadherin（Ad-N-cad）、Ad-si N-cadherin（si N-cad）及Ad-GFP、Ad-si Control（si Con）对照腺病毒处理细胞以过表达或沉默N-cadherin,采取葡萄糖（25mmol/L）处理视网膜色素上皮细胞以模拟高糖状态,使用CCK8试剂检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞的垂直迁移能力及侵袭能力。【结果】Transwell迁移和侵袭实验结果表明,过表达N-cadherin使迁移至Transwell小室下室的细胞数增加,差异有统计学意义（P<0.05）;高糖处理使迁移和侵袭至小室下室的细胞数增加,而干扰N-cadherin的表达可抑制高糖诱导的迁移或侵袭（P<0.05）。CCK8结果显示,干扰N-cadherin可以抑制高糖引起的细胞增殖（P<0.05）。【结论】N-cadherin可促进细胞迁移,干扰N-cadherin可以抑制高糖诱导的细胞增殖、迁移和侵袭。     

人纤溶酶原K5突变体滴眼液对大鼠角膜移植植片存活时间的影响

目的 探讨人纤溶酶原K5突变体(mK5)滴眼液预防大鼠角膜移植排斥反应发生的效果.方法 实验研究.以F344大鼠30只作为供体,Lewis大鼠60只作为受体,建立同种异体角膜移植排斥反应模型.另取15只Lewis大鼠行自体原位角膜移植,即A组为15只F344大鼠自体原位角膜移植.采用完全随机分组设计方案,将60只Lewis大鼠(60只右眼)分为B、C、D及E组.术后术眼4次/d滴眼液,每次1滴,A组和B组滴生理盐水,C组和D组滴mK5滴眼液,浓度分别为5 mg/L和10 mg/L,E组给予0.1%地塞米松滴眼液,连续用药14 d.根据Holland排斥反应评分标准,判断术后植片排斥情况.比较各组角膜植片的平均存活时间,并观察各时间点角膜新生血管生长情况,计算其面积.术后第14天,对各组大鼠角膜植片做组织学检查.采用方差分析和SNK-q检验对以上所得结果进行统计学分析.结果 B、C、D、E组植片平均存活时间分别为(9.3±2.1)、(21.1±7.3)、(23.5±10.8)及(28.2±19.1)d;C、D组分别与B组比较,差异有统计学意义(q=10.24,13.47:P<0.05);E组植片存活情况较C、D组好,但组间比较,差异无统计学意义(q=2.54,1.49;P>0.05).术后A、B、C、D及E组角膜新生血管开始出现的时间分别为(3.1±0.8)、(2.6±0.5)、(6.4±0.5)、(7.8±0.7)及(5.3±1.0)d;C、D、E组与A组比较(q=31.58,51.21,19.98;P<0.05);C、D、E组也较B组明显延长(q=43.87,67.14,24.53;P<0.05);C、D及E组两两组间比较差异有统计学意义(q=11.41,20.37,9.67;P<0.05).术后C、D组角膜新生血管的生长面积明显较B组少(q=30.76,62.14;P<0.05),且与E组比较差异有统计学意义(q=15.20,25.64;P<0.05).病理学检查显示,B组角膜植片可见大量炎性细胞浸润和角膜新生血管形成,而C组与D组植片炎性反应较轻,无明显新生血管形成.结论 mK5滴眼液可抑制同种异体大鼠角膜移植术后新生血管的生成,延缓角膜移植排斥反应的发生.     

抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定

目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。