探究3C蛋白酶切割p51在B组柯萨奇病毒致病毒性心肌炎中的作用

【立题依据】 B组柯萨奇病毒(CVB)是病毒性心肌炎的主要病原体,可引发扩张型心肌病,尚无治疗药物。CVB的3C蛋白酶切割前体蛋白形成结构蛋白,完成病毒复制,也通过切割宿主蛋白发挥致病作用。我们发现宿主细胞中一个长约51kDa的蛋白质(其功能尚不清楚,暂称为p51)有3C蛋白酶的特异性酶切位点,推测p51是CVB的作用靶点之一,3C蛋白酶切割p51可能是CVB致病的新机制。 【设计思路】 通过蛋白质过表达和沉默等分子生物学技术,在细胞和动物实验中证实CVB 3C蛋白酶可以切割p51,并通过通过切割p51发挥致病作用。 【实验内容】 本实验设计通过以下4方面研究CVB通过其3C蛋白酶切割p51致病的作用机制:(1)构建真核表达载体质粒pEGFP-p51;(2)细胞实验确定3C蛋白酶通过特异性位点切割p51;(3)细胞实验确定CVB通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用;(4)动物实验确定3C蛋白酶可以切割p51并在CVB致病毒性心肌炎中发挥作用。 【材料】 HeLa细胞;Balb/c小鼠;CVB3,嗜心肌CVB3 H3株;质粒:pEGFP-C1,pEGFP-2A,pEGFP-3C;干扰RNA:通过商业渠道购买。 【可行性】 本实验设计有充分依据表明p51有CVB 3C蛋白酶的酶切位点,CVB可能通过3C蛋白酶切割p51发挥致病作用,从而导致病毒性心肌炎和扩张型心肌病。 【创新性】 通过本实验,我们可能揭示CVB致病的新机制,能够更加全面地了解CVB致病毒性心肌炎的分子机制,为研发抗CVB药物提供新靶点,为临床治疗提供新方向,有广泛的应用前景。     

IL-12、IL-7分别与IL-2协同对人PBMC增殖和细胞毒作用影响的体外研究

应用同位素３ＨＴｄＲ掺入法和３ＨＴｄＲ释放法比较了重组ＩＬ１２、ＩＬ７单独或分别与ＩＬ２协同对健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的体外增殖和细胞毒活性的影响。结果表明，ＩＬ７单独即可促进ＰＢＭＣ增殖分化和诱导产生细胞毒活性，与ＩＬ２协同可使２种作用均增强，并高于单独用ＩＬ２时的效应。ＩＬ１２单独不能引起ＰＢＭＣ增殖但可诱导ＰＢＭＣ产生细胞毒活性，与ＩＬ２协同可使２种效应明显增强。     

加强病原实验教学基地建设,培养学生综合素质

通过痛原生物学实验教学基地的建设，开展课堂教学改革和课外创新活动，培养学生动手能力和创新能力；充分利用课堂教学各环节提高学生思想素质和科学素质，达到提高教学质量的目的，逐渐把实验教学中心建设成为培养学生综合素质和创新能力的基地。     

学导式教学法在微生物学教学中的改革实践

在医学微生物学的理论教学中,使用病案导入式教学方法,并加强学生在学导式教学中的角色,相应的采取形成式考核方式,这些方式在提高学生学习能力的同时,增加了其综合分析能力、知识的灵活运用和交流能力,是培养创造型、开拓型、实用型医学人才过程中的一次有益尝试。     

柯萨奇B2病毒VP1基因疫苗诱导细胞免疫的初步研究

目的　构建柯萨奇B2 病毒 (CVB2 )VP1侯选基因疫苗 ,评价其诱导细胞免疫的效果。方法　采用逆转录PCR技术扩增CVB2 的主要中和抗原VP1基因 ,通过分子克隆构建 pcDNA3 CVB2 VP1基因免疫质粒并免疫BALB/c小鼠 ,51Cr释放法测定CTL杀伤效应。结果　基因免疫质粒表达载体为 pcDNA3 ,亚克隆片段为CVB2 VP1,pcDNA3 CVB2 VP1接种组CTL特异性杀伤百分率均高于 pcDNA3 组 (P <0 0 1) ,E/T为 5 0∶1时特异性CTL杀伤百分率最高 ,为 (31 2± 6 8) % (P <0 0 5 )。结论　pcDNA3 -CVB2 VP1可诱导小鼠产生细胞免疫。     

琼脂糖凝胶电泳法快速筛选轮状病毒

本文用琼脂糖凝胶电泳检测轮状病毒RNA,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果相比较,结果43份聚丙烯酰胺凝胶电泳阳性的标本,琼脂糖凝胶电泳亦均为阳性。两种方法检测轮状病毒RNA的敏感度一致,而琼脂糖电泳省时、简便、经济。可作为一种快速方法用于轮状病毒感染的筛选和快速诊断。     

柯萨奇病毒B1/B3型二价VP1基因疫苗的构建及其免疫试验

目的 构建柯萨病毒（CV）B1／B3型二价VP1免疫质粒,并探讨其免疫原性。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术扩增CVB1的主要中和抗原VP1基因,将分别由CMV和SV40启动子控制的 CVB1和CVB 3的VP1基因反向串联插入到真核表达载体pCR3-Uni中。将该质料一转染鼠NIH3T3细胞,于转染后24、48、96h进行免疫荧光及RT－PCR检测,应用重组质粒免疫BALB／c小鼠,于免疫前、免疫后2 、4、6周分别断尾采血,用ELISA方法检测CVB特异性抗体。结果 获得了含有CVB1和CVB3的VP1南粒,RT－PCR及免疫荧光检测结果表明该质粒在NIH3T3细胞获得瞬时表达,小鼠免疫后4、6周均有特异性抗体产生。结论 本研究构建的CVB1／B3型二价VP1基因疫苗能诱导小鼠产生CVB特异性抗体,可以作为候选基因疫苗。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.