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人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒的快速构建及其鉴定 总被引:2,自引:1,他引:1
目的 构建人的AWP1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因的重组腺病毒载体,为研究AWP1的生物功能提供工具。方法将克隆的AWP1 cDNA插入高效表达RFP的载体pDsRedl-N1的多克隆位点,与RFP序列形成AWP1-RFP融合基因,将该融合基因亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV和pAdShuttle-CMV中:经酶切鉴定正确后Pine I线形化,与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183以同源重组:用lipofectAMINE将Pac I线形化的同源重组腺病毒载体转染293细胞以包装腺病毒:通过同源重组病毒载体和病毒颗粒基因组的DNA测序及PCR扩增和在293细胞中的表达鉴定重组腺病毒。结果同源重组载体和病毒颗粒的DNA测序和PCR分析显示AWPIcDNA序列正确,感染293细胞获得了AWP1-RFP融合蛋白的高效表达。结论成功构建和包装了人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒。 相似文献
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目的: 研究阻断ERK途径对地塞米松(DEX)诱导的胸腺细胞凋亡中线粒体膜电势的影响。 方法: 利用PD098059(PD)阻断小鼠胸腺细胞ERK途径,分别设对照组(control)、单纯PD组(PD only)、DEX组和PD+DEX组;在3 h、5 h和7 h时点,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;在3 h、7 h和11 h,利用JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势(△ψm)变化。 结果: 在1 μmol·L-1 DEX刺激下,小鼠胸腺细胞在3 h、5 h和7 h凋亡率分别为(19.63±0.35)%、(41.84±1.67)%和(67.00±2.43)%,对照组分别为(4.98±0.39)%、(6.08±0.33)%和(9.31±0.34)%,差异显著(P<0.01);相同时点下,PD only组细胞凋亡率分别为(7.95±0.60)%、(10.69±0.48)%和(22.20±1.24)%,显著高于对照组(P<0.01);PD+DEX组在3 h和5 h时点细胞凋亡率显著高于DEX组(P<0.01),而在7 h时点,两组差异不显著(P>0.05)。在3 h、7 h和11 h,DEX组△ψm降低的细胞比率分别为(21.23±1.43)%、(55.34±1.78)%和(70.88±2.87)%,对照组分别为(5.25±1.22)%、(8.01±0.97)%和(12.88±1.10)%,差异显著(P<0.01);相同时点下,PD only组△ψm降低的细胞比率分别为(11.09±2.00)%、(16.21±2.25)%和(21.15±3.70)%,显著高于对照组(P<0.01);PD+DEX组在3 h和5 h时点细胞凋亡率显著高于DEX组,分别为(30.55±2.99)%和(65.22±4.32)%(P<0.01),11 h时点两组差异不显著(P>0.05)。 结论: DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡至少部分通过ERK途径,阻断ERK途径在该凋亡过程中具有重要生物学意义。 相似文献
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应用免疫组织化学PAP法对亮氨酸-脑啡肽(L-ENK)神经纤维在猫颞下颌关节(TMJ)内的分布作了研究。结果表明:TMJ囊及关节盘前后附着内均见L-ENK阳性纤维分布,并以细枝丛状分布多见;关节囊滑膜下层的阳性纤维分布密度最高,并可见丛状结构突向滑膜层;关节囊外侧壁及关节盘前后附着内的阳性纤维分布密度相似,关节盘中部未见阳性纤维分布。结果提示:TMJ内存在内源性镇痛机制的物质基础 相似文献
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目的研究阻断p38途径对地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导的胸腺细胞凋亡的影响。方法WesternBlott检测DEX对p38途径的阻断作用。以SB203580(SB)阻断BALB/c小鼠胸腺细胞p38途径,在3、5和7h,利用An-nexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;利用DiOC6(3)/PI双染流式细胞术检测线粒体膜电势(△ψm)和细胞膜完整性变化。结果DEX显著减少了胸腺细胞p38蛋白含量;阻断p38后DEX诱导小鼠胸腺细胞晚期凋亡率显著增加(P<0.01);DEX诱导了胸腺细胞△ψm降低,同时阻断p38途径后,DiOC6(3)阴性PI阳性细胞显著增多(P<0.01)。结论阻断p38后加速了DEX介导的小鼠胸腺细胞凋亡中细胞膜完整性的破坏,该现象可能与线粒体功能有关。 相似文献
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TLR9的特性及其介导CpG DNA的信号通路 总被引:1,自引:0,他引:1
固有免疫应答细胞表面有限的受体如何识别种类繁多的异己抗原,一直是困扰医学界的一个难题。机体识别微生物非己成分是基于对病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP)的识别。PAMP是多种微生物所共有的一类特殊的保守结构,其化学性质多属于糖脂结构,真核细胞一般不表达。目前已发现多种PAMP,包括G^-菌的脂多糖、G^+菌的肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸、分支杆菌的脂聚糖和酵母菌的甘露糖等。最近发现,细菌来源的非甲基化CDGDNA也是一种PAMP,其识别受体是Toll样受体(Toll like receptor,TLR)家族成员——TLR9。本文就TLR9介导的CpGDNA信号传导机制作简要综述。 相似文献
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目的:研究CpGODN在BALB/C小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)抗肝癌免疫中的作用。方法:CpGODN联合肿瘤抗原(TAg)体外刺激BMDC,流式细胞术检测受刺激BMDC表达CD80的阳性率,ELISA检测受刺激BMDC分泌IL-12(p70)的水平,MTT法检测活化BMDC刺激T细胞的增殖能力,联合CpGODN和TAg体内预激小鼠获得CTL,检测CTL对肝癌细胞株Hca-F的特异性杀伤作用。结果:CpGODN联合TAg体外可明显激活BMDC,诱导BMDC膜表面CD80的表达,刺激BMDC分泌高水平IL-12,促进BMDC刺激T淋巴细胞增殖;体内联合应用CpGODN和TAg诱导的CTL对Hca-F具有强大的特异性杀伤作用,其诱导作用明显强于TAg,与细菌脂多糖和金黄色葡萄球菌肠毒素B相近。结论:CpGODN体外能有效促进小鼠BMDC的分化、增殖和成熟,体内与TAg联合应用可显著增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。 相似文献
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目的:探讨可溶性Jagged-1/Fe嵌合蛋白(Jagged-1)对重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)产生细胞凶子的影响.方法:建立rmCM-CSF和rmIL-4体外诱导DC的模型,观察Jagged-1/Fc对DC分化的形态学影响.通过Luminex蛋白液相芯片技术和ELlSA检测其细胞因子的表达水平,藉MTT法测定可溶性Jagged-1/Fc诱导的DC对同种异基因淋巴细胞增殖的刺激能力.结果:除了TGF-β,Jag-ged-1/Fc诱导的DC与细菌脂多糖(LPS)或酵母聚糖A诱导的DC不同,表现为生成TNF-α的水平明显降低,IL-4显著增高,而IL-10、IL-6、IL-2、IL-12和IFN-γ的水平与对照组无明显差异.γ分泌酶抑制剂DAFT能逆转Jagged-1/Fc抑制DC生成TNF-α.混合淋巴细胞反应显示Jagged-1/Fc诱导的DC对T细胞增殖的刺激能力最弱,LPS诱导的DC的刺激能力最强.结论:Jagged-1/Fc诱导的DC倾向介导免疫耐受,指导初始T细胞向Th2细胞偏离. 相似文献