CCK-8抑制LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞TNF-α转录及NF-κB活性

目的:观察硫酸化八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)TNF-α基因表达的影响,探讨核因子κB(NF-κB)是否参与这一过程,以揭示CCK-8抗炎作用的信号转导机制。方法:分离大鼠肺PIMs,经LPS、CCK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3h,用RT-PCR技术检测细胞TNF-αmRNA的表达,孵育1h,用电泳迁移率改变分析方法检测NF-κB活性,孵育30min,用Westernblot技术检测胞浆IκBα蛋白表达情况。结果:CCK-8(10^-8-10^-6mol·L^-1)明显降低了LPS诱导的TNF-αmRNA表达及NF-κB活性,增加了胞浆中IκBα蛋白水平,呈剂量依赖性,并可被丙谷胺所拮抗。结论:对LPS激活的肺PIMs,CCK-8通过抑制NF-κB活性而抑制其TNF-αmRNA表达,该作用由CCK受体介导,并与CCK-8减少IκBα蛋白降解有关,此为CCK-8抗炎作用的机制之一。     

八肽胆囊收缩素抑制脂多糖诱导的大鼠肺间质巨噬细胞CD14的表达

目的:初步探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)激活大鼠肺间质巨噬细胞(IM)的调节作用。方法:分离大鼠肺IM,经LPS、CCK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或共同孵育后,测定细胞CD14的表达及上清中TNF-α含量。 结果:LPS(1 mg/L)孵育12 h,肺IM mCD14表达上调,上清中sCD14及TNF-α含量均明显增加;CCK-8(10^-7-10^-6 mol/L)抑制了LPS的上述效应,且可被丙谷胺所拮抗。结论:CCK-8对LPS激活的肺IM的部分功能具有抑制性调节作用,该作用是由其受体介导的,可能是CCK-8减轻内毒素血症时肺组织炎性变化的重要机制之一。     

一氧化氮在八肽胆囊收缩素抗脂多糖致离体兔胸主动脉低血管反应性中的作用

目的:探讨一氧化氮(NO)在八肽胆囊收缩素(CCK-8)减轻脂多糖(LPS)致离体兔胸主动脉收缩反应降低中的作用。方法:用LPS、LPS+CCK或溶剂孵育离体兔胸主动脉环14h,检测其对苯肾上腺素(PE)的收缩反应,及PE预收缩后对NO合酶(NOS)底物L-精氨酸的反应;用NOS抑制剂氨基胍(AG)或N^ω-硝基-L-精氨酸(L-NNA)预孵育后胸主动脉环对PE收缩反应的变化,并检测胸主动脉NOS活性。结果:LPS孵育胸主动脉环14h,导致其对PE的收缩反应明显降低,NOS活性明显增高;同时加入CCK-8则明显提高胸主动脉环对PE的收缩反应,程度与AG一致,且抑制LPS诱导的NOS活性。结论:CCK-8减轻LPS致离体兔胸主动脉收缩反应降低的作用与抑制NOS活性、减少NO生成有关。     

蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞cAMP反应元件结合蛋白活性的影响

目的： 观察RSC-364细胞外源性亚硝基化对cAMP反应元件结合蛋白（CREB）活性的影响。方法：提取RSC-364细胞总蛋白,与100 μmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、100 μmol/L NO供体亚硝基化谷胱甘肽(GSNO)、10 mmol/L亚硝基化抑制剂二硫苏糖醇(DTT)及溶剂单独或联合应用孵育15 min完成外源性亚硝基化，采用生物素转化法与Western blotting技术检测亚硝基化蛋白表达水平；分别用溶剂或重组大鼠白细胞介素-1β(rIL-1β)10 μg/L孵育RSC-364细胞1 h，提取细胞核蛋白，经外源性亚硝基化后用电泳迁移率改变分析(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)观察亚硝基化作用对CREB活性的影响。结果：RSC-364细胞总蛋白经GSNO孵育后亚硝基化蛋白表达水平明显增高，而应用DTT可抑制亚硝基化水平；GSNO与RSC-364细胞核蛋白孵育后，明显抑制了rIL-1β诱导的CREB活性(P<0.01)，GSNO的作用可被DTT所逆转(P<0.01) 。结论：NO可通过亚硝基化作用抑制RSC-364细胞CREB活性。     

CRE-decoy ODN对慢性吗啡诱导SK-N-SH细胞CCK及fosB mRNA表达上调的抑制作用

目的：研究以转录因子cAMP反应元件结合蛋白 (CREB) 为靶点的 CRE-decoy ODN对慢性吗啡诱导SK-N-SH细胞胆囊收缩素 (CCK) 及fosB mRNA表达上调的抑制作用。 方法： 体外合成含cAMP反应元件CRE 序列TGACGTCA的单链寡核苷酸，将自身杂交形成发卡结构。将终浓度为150 nmol/L的CRE-decoy ODN与SK-N-SH细胞孵育1 h后，加入终浓度为100 μmol/L的吗啡作用48 h，随后加入终浓度为10 μmol/L的纳络酮，戒断15 min。采用电泳迁移率改变分析 (EMSA) 检测CRE-decoy ODN与CREB结合的序列特异性及其对慢性吗啡诱导的CREB的DNA结合活性升高的影响；细胞掺入的CRE-decoy ODN 用酚：氯仿法提取，经20%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影检测; 采用RT-PCR检测CCK及fosB mRNA表达。 结果： 慢性吗啡作用及纳络酮急性戒断使SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性、CCK和fosB mRNA表达明显升高，CRE-decoy ODN可特异抑制其升高。 结论： CRE-decoy ODN通过特异抑制慢性吗啡诱导SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性而下调CCK及fosB mRNA表达。     

钥孔戚血蓝蛋白诱导BALB/c小鼠变态反应性肺炎及机制初探

目的 探讨钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)诱导BALB/c小鼠变态反应性肺炎的特点及机制,为深入研究慢性肺部炎症性疾病奠定基础.方法 以KLH免疫BALB/c小鼠,HE染色观察小鼠肺组织病理变化;[3H]TdR法检测脾细胞增殖;流式细胞法检测外周血及脾细胞中CD4+、CD8+T细胞阳性百分率;RT-PCR法检测脾细胞中Th1型细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)和Th2型细胞因子白介素4(IL-4)mRNA表达;ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4含量及血清中Th1型抗体IgG2a和Th2型抗体IgG1水平.结果 ①KLH免疫致小鼠变态反应性肺炎;②KLH免疫促进小鼠脾细胞增殖;③KLH免疫致小鼠CD4+T细胞过度活化;④KLH免疫致小鼠Th2优势反应.结论 KLH免疫使小鼠免疫细胞活化并发生变态反应性肺炎,CD4+T细胞过度活化和Th2优势应答可能参与了其发病过程.     

八肽胆囊收缩素抑制脂多糖诱导的大鼠肺间持质巨噬细胞NF—κB活性

目的探讨脂多糖(LPS)所致离体肺动脉反应性张力变化与肺动脉内源性一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)的关系.方法制备离体兔肺动脉环.①对照组,培养基中加入生理盐水溶剂;②LPS组,培养基中加入LPS4μg/mL.两组孵育7h,检测肺动脉环对10-6mol/L新福林(PE)的收缩反应及对l0-6mol/L乙酰胆碱(ACh)的内皮依赖性舒张反应,以及一氧化氮合酶(NOS)抑制剂氨基胍(AG)和N+-硝基-L-精氨酸(L-NNA),血红素氧合酶-l(HO-1)抑制剂锌卟啉原(ZnPP)预孵育20min后,肺动脉环对PE及ACh反应性的改变.结果①LPS孵育7h时肺动脉环对ACh的内皮依赖性舒张百分比显著低于对照组(P＜0.05),而不影响肺动脉环对PE的收缩反应;②两组用10-4mol/LAG、10-5mol/LZnPP预孵育20min后,LPS组对ACh的舒张百分比显著降低,对PE的收缩值显著增加(均P值＜0.01),对照组对ACh的舒张百分比均无显著改变.10-4mol/L-NNA预孵育20min后,两组对ACh反应均表现收缩,对PE的收缩反应较孵育前(对照)均显著增加(P＜0.01),而与AG孵育后的PE收缩值比较,LPS组无显著差异,对照组显著增加.讨论内皮源性NO在血管张力的调控上起重要作用,ACh为内皮依赖及受体依赖性舒血管物质,内皮源性NO介导其舒张反应.实验结果表明,LPS孵育后,肺动脉内皮依赖性舒张反应显著降低,对PE收缩反应无明显变化,提示LPS可能直接损伤了肺动脉内皮细胞功能,如抑制cNOS活性,妨碍NO生成与释放;AG预孵育后LPS组对PE收缩显著增强,提示,LPS可引起iNOS诱生;ZnPP预孵育后LPS组收缩反应显著增强,ACh舒张百分比下降,溶剂对照组收缩反应也增强,但ACh舒张百分比与孵育前比较无显著差异.提示CO参与生理和病理情况下的血管张力的调控.结论①LPS可导致离体兔肺动脉内皮依赖性舒张反应减弱;②LPS对肺血管的损伤作用与NO有关,提示LPS可使内皮cNOS活性下降,CO在LPS损伤中起一定的作用,但其与NO的关系有待于进一步探讨.     

河北汉族人群5个X-STR基因座遗传多态性研究

短串联重复序列(short tandem repeat,STR),由于其具有高度的稳定性、丰富的多态性及分型技术简单、快速等优点,已成为目前法医学中最主要的遗传标记.     

CCK-8抗TNF-α抑制离体兔肺动脉舒张反应性的机制

肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）是内毒素诱导肺动脉高压（ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ＰＡＨ）的重要前炎症介质，给动物单独注入ＴＮＦ－α也可引起于内毒素血症中所见到的ＰＡＨ，但其机制尚未完全明了...     

外周血单个核细胞hMLH1启动子甲基化与类风湿关节炎发生发展的关系

目的 探讨错配修复基因-hMLH1启动子甲基化及基因失活在类风湿关节炎(RA)发生发展中的作用。方法 选取2006年4月-2007年4月河北医科大学附属第二医院及第三医院新诊断的RA患者33例为病例组,另选择同期河北省血液中心提供的健康人群38例为对照组。取受试者外周血,以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。分别以RT-PCR法、蛋白印迹法检测外周血单个核细胞hMLH1 mRNA、蛋白相对表达量。经亚硫酸氢钠修饰后,分别设计hMLH1启动子甲基化和非甲基化的DNA引物,检测病例组和对照组患者hMLH1启动子甲基化结果。结果 病例组hMLH1 mRNA相对表达量为0.56（0.24,0.69）,低于对照组的0.80（0.68,0.93）,差异有统计学意义（Z=-3.98,P＜0.05）。病例组hMLH1蛋白相对表达量为0.70（0.62,0.76）,低于对照组的0.80（0.68,0.94）,差异有统计学意义（Z=-2.23,P＜0.05）。病例组hMLH1启动子甲基化阳性率为90.9%（30/33）,高于对照组的13.2%（5/38）,差异有统计学意义（χ2=42.72,P＜0.05）。hMLH1启动子甲基化程度与mRNA、蛋白相对表达量呈负相关(rs=-0.866、-0.541,P＜0.01)。类风湿因子阳性患者hMLH1 mRNA、蛋白相对表达量低于阴性患者,差异有统计学意义（P＜0.05）;两者hMLH1启动子甲基化阳性率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 hMLH1启动子甲基化可能是hMLH1基因失活的重要机制,hMLH1异常高甲基化可能参与了RA的发生发展。