人卵黄囊间质干细胞的分离纯化及诱导成脂的实验研究

目的:分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞(YS-MSC)分化为脂肪细胞。方法:显微分离人卵黄囊, 经酶消化得到卵黄囊细胞, 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到人YS-MSC, 流式细胞仪检测YS-MSC表面抗原表达, 钙钴法测定碱性磷酸酶(AKP)活性;地塞米松、消炎痛、胰岛素定向诱导YS-MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪。结果:人卵黄囊间质干细胞易于分离、纯化, 体外培养增殖潜能大。卵黄囊间质干细胞CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性, CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性。卵黄囊间质干细胞经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞, 可见胞浆内有少量微小脂滴形成, 随时间延长, 胞浆中脂滴相互融合, 胞核被挤于细胞的一侧, 经油红O染色脂滴染橘红色, 符合脂肪细胞的生物学特征。结论:人卵黄囊间质干细胞与成体间质干细胞表型一致, 在体外可以分化为脂肪细胞。     

哮喘患儿血浆和淋巴细胞诱生γ－干扰素水平的检测及其意义

应用生物素－亲合素双抗体夹心酶联免疫吸附分析技术（ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ）检测了２４例哮喘患儿血浆和外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）诱生γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）水平。结果显示：患儿血浆ＩＦＮ－γ水平极低（１．３３±０．０８μｇ／Ｌ），经植物血凝素（ＰＨＡ）刺激后，ＰＢＭＣ诱生ＩＦＮ－γ水平仍明显低于正常对照组（Ｐ＜０．００１）。哮喘患儿血清总ＩｇＥ水平明显升高。用麻疹疫苗治疗后ＩＦＮ－γ诱生水平无明显变化。提示患儿体内细胞因子产生失衡，ＩＦＮ－γ产生减少与哮喘的发病、病程和易诱发病毒反复感染有一定关系。     

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的观察在体外培养条件下,具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析,并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较.方法实验于2003-08/2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成.①动物分组选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体,供分离骨髓间质干细胞;雌性6周龄Wistar大鼠60只,其中50只被造成肝纤维化模型,在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天,将造模大鼠随机分为2组骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体),于治疗39 d后结束实验,取材分析病理对照组40只.另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水).②肝纤维化模型制作在实验的当天,给予10g/L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1 mL/kg,腹腔注射,每周连续3次,共6周.③骨髓间质干细胞治疗组每只大鼠输注3×106个骨髓间质干细胞;病理对照组使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞.④动物的一般生活状态每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等.⑤肝脏的组织细胞形态结构将肝组织以苏木精-伊红染色后观察.⑥肝星形细胞及其活化程度检测前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量,用免疫组织化学染色法,后者以德国IBAS2.5图像分析软件半定量分析.⑦肝脏胶原分布的相对含量检测采用Masson三色染色法,从而反映肝纤维化程度.⑧肝脏羟脯氨酸含量测定采用氯胺T法.⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测采用全自动生化分析仪.⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定采用放射免疫法.11雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测采用聚合酶链式反应.12统计学分析两组样本均数比较采用t检验;多组样本均数比较采用方差分析,两两比较采用q检验;生存分析采用K,plan-Meier法.结果雌性大鼠60只进入结果分析.①实验动物生存状况造模6周后,骨髓间质干细胞治疗组生存率为80%,而病理对照组生存率为10%,空白对照组生存率为100%,说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展,从改而善大鼠的生存率.②肝脏组织学显示,骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善,炎症减轻、假小叶结构减少或消散.相反,病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑,包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死.半定量分析胶原染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8.12±1.98,15.71±2.13,t=6.11,P＜0.05).③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达,而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达.半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11.06±2.03,18.50±3.87,t=4.47,P＜0.05).④Y染色体性别决定区基因的表达经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39 d的雌性大鼠,肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示,Y染色体性别决定区基因的表达阳性,而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号.说明骨髓间质干细胞移植后,能够在受体肝内存活5周以上.⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P＜0 05)但明显低于病理对照组(P＜0.05),说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量,从而减少肝纤维化的形成,使肝纤维化得到控制.⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P＜0.05),接近空白对照组.说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态.结论①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立.②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能.③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生,抑制肝纤维化形成.④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一.⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上.     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

B7-1和IL-12基因转染对肝癌细胞免疫原性的影响

目的 观察Ｂ７－１和ＩＬ－１２基因表达对人肝癌细胞免疫原性原影响。方法 分别将Ｂ７－１和ＩＬ－１２基因以逆转录病毒介导转染ＨｅｐＧ２细胞。阳性克隆细胞与健康人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）混合培养后,用流式细胞仪检测ＰＢＬ表面Ⅰ类人白细胞抗原（ＨＬＡ－Ⅰ）分子表达,以ＭＴＴ法检测ＰＢＬ的特异性杀伤活性Ｋ５６２细胞的活性。结果 混合ＨｅｐＧ２／Ｂ７－１ＨｅｐＧ２／ＩＬ－１２细胞组ＰＢＬ表面的ＨＬＡ－Ⅰ分子     

转移的小鼠MHC-Ⅰ类基因在受体小鼠体内的较长期表达

目的 探讨表达供体ＭＨＣ－Ⅰ类基因的造血细胞嵌合体回输受体小鼠后,能否在受体内较长时间表达。方法 由逆转录病毒载体介导,将供体小鼠（Ｃ５７ＢＬ／６）的ＭＨＣ－Ⅰ类基因导入受体小鼠（ＢＡＬＢ／ｃ）的造血细胞,并用聚合酶链反应、逆转录－聚合酶链反应和流式细胞仪进行检测。结果 逆转录病毒载体重组质粒转染的受体ＢＡＬＢ／ｃ小鼠造血细胞及其形成的ＣＦＵ－ＧＭ中均整合了供体小鼠的ＭＨＣ－Ⅰ类基因,且能转录为ｍＲＮＡ,在其细胞膜上均有ＭＨＣ－Ⅰ类抗原的表达。结论 ＭＨＣ－Ⅰ类基因已稳定地整合进受体小鼠造血细胞的基因组内,且可以在受体内表达较长时间。     

T淋巴细胞表达杀伤细胞抑制性受体的研究进展

Only in recent years,attentions have been drawn to the significance of expressing killer cell inhibitory receptors(KIR)in T cells.KIRs specifically bind to the corresponding region of the MHC class I molecules and transmit negative signals to prevent cytotoxity of T cells.When the ligands of KIRs are missing,the lysis of the target cells can‘t be avoided.Perhaps the existence of KIRs is the main mechanism for preventing T cells from attacking autologous tissues.The recognition mechanism of the interaction between the KIR^ donor T cells and the recipient‘s MHC class I molecule expressing tissue cells might shed light on the establishment of the immunotolerance for the prevention of allo-graft rejection and graft-versus-host disease.     

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,FGF-2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10⁶,15代可获得(2-3)×10¹²个细胞,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。FGF-2促进hMSC生长,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:丹参酮ⅡA可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

体外培养诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肌样细胞的实验研究

目的:体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为肌样细胞。方法:采用常规技术对SD鼠MSCs进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和免疫组化、透射电镜检测分析。结果:流式细胞仪检测, 细胞表达CD29和CD44, 不表达CD11b和CD45;经一定浓度5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后细胞desmin和myoglobin染色阳性;电镜观察肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带。结论:传代贴壁生长的梭形细胞为MSCs。MSCs可能具有表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因;5-氮胞苷等化合物可使DNA的胞嘧啶去甲基化, 从而诱导MSCs向肌源性细胞分化。临床有运用MSCs治疗肌萎缩性疾病的前景。     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。