α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的　研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2 ,6唾液酸转移酶 (ST6GalI)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响 .方法　结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalIcDNA或反义ST6GalIcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3 .1,以RT -PCR检测转染子ST6GalImRNA的表达 ,流式细胞仪检测细胞表面α2 ,6唾液酸含量 .结果　转染正义ST6GalIcDNA的克隆显示ST6GalImRNA的表达增强以及接骨木凝集素 (SNA)与细胞表面成分的结合增加 ;而转染反义ST6GalIcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalImRNA的表达减少 ,SNA与细胞表面成分的结合力降低 .结论　ST6GalI的表达直接影响细胞表面α2 ,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能 .利用反义核酸技术抑制ST6GalI的表达并降低肿瘤细胞表面α2 ,6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段     

结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达

目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.     

ATP及其衍生物影响不死化人成纤维细胞增殖的实验研究

目的:探讨ATP及其衍生物对不死化人成纤维细胞的增殖抑制作用,并通过P₂嘌呤能受体从而了解ATP发挥细胞毒性作用的途径。方法:使用ATP及其衍生物ATP-Na₂,ATP-Mg,ADP,MeATP,BzATP,ATPγS,2-MeSATP和UTP在不同条件培养KMST-6人不死化成纤维细胞,检测细胞增殖状况,Westernblot分析、流式细胞仪检测细胞增殖周期以及Hoechst33258特异性细胞染色和DNA电泳检测细胞凋亡。结果:ATP及其衍生物对细胞增殖抑制作用的程度依次为:ATP=ADP＞ATPγS＞MeATP=BzATP;而2-MeSATP和UTP却未显示任何细胞毒性作用;0.4mmol/LATP培养48h时P²¹表达未见增高,细胞增殖停止于G₁／S期;1mmol/LATP培养48h时未发现细胞凋亡。结论:通过与P_2X或P_2Y嘌呤能受体相结合,ATP激活细胞内某些信号传导发挥细胞增殖的抑制作用;ATP引起增殖抑制不是通过细胞凋亡或者是周期素／CDK激酶抑制剂P²¹所致。     

α2,6-唾液酸对结肠癌细胞同源凝集的影响

目的研究结肠癌细胞LS174T的α2,6-连接的唾液酸水平对肿瘤细胞同源黏附功能的影响。方法结肠癌细胞株LS174T转染α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)cDNA或ST6Gal-I cDNA的部分反义序列以及空载体pcDNA3.1,以流式细胞仪检测转染细胞表面α2,6-连接唾液酸含量并进行克隆分选,比较顺义、反义以及空载体转染细胞的贴壁时间以及细胞-细胞之间的同源凝集效应。结果转染顺义的ST6Gal-I cDNA的细胞克隆显示ST6Gal-I mRNA的表达增强,SNA(一种特异性识别α2,6-连接唾液酸的植物凝集素)与细胞表面成分的结合增加;另一方面,细胞转染反义ST6Gal-I cDNA后其ST6Gal-I mRNA表达减少,SNA与细胞表面成分的结合力降低。与空载体转染相比,顺义转染的细胞克隆同源凝集作用降低,与细胞外成分的黏附作用增强,贴壁速度加快;反义转染细胞克隆同源凝集作用显著增强,与细胞外成分的黏附作用降低,传代后4 h的贴壁率仅为空载体的53.7%。结论本实验结果显示,肿瘤细胞α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)的表达将有效影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的黏附功能。     

ATP对人不死化成纤维细胞DNA的合成、膜蛋白表达及离子通道的影响

目的：探讨ATP抑制不死化人成纤维细胞增殖过程中对其DNA合成，细胞膜蛋白的表达以及离子通道的影响，方法：将正常人TIG－7和OUMS－36细胞株，不死化人KMST－6和SUSM－1细胞株在不同浓度的ATP，ADP，AMP条件下分别进行24和96h的常规细胞培养，观察存活细胞数目，DNA的合成，[32P]ATP标记膜蛋白的表达以及不死化KMST－6的细胞分别在无钙离子培养基和应用Ca^2 和K^ 通道拮抗剂时，细胞增殖率的改变，结果：培养96h后，0．4mmol/L ATP对不死化细胞KMST－6的抑制率为77％，且DNA合成明显地被抑制，而正常OUMS－36细胞抑制率为41％，且DNA合成无明显改变，在1mmol/L ATP时，多数KMST－6细胞发生死亡，而正常OUMS－36细胞的增殖无明显影响，当ADP，AMP和腺苷或磷酸处理的细胞，仅有ADP处理的不死化细胞存活数目减少（P＜0．01），与正常细胞比较，不死化细胞30，31，33和40kD的[^32P]-ATP标记膜蛋白呈高表达，0．4mmol/L ATP与KMST－6细胞共培养时分别加入Ca^2 以及K^ 通道拮抗剂，这些药物在某种程度上可以降低ATP的增殖抑制作用，当ATP处理的细胞液中无钙离子时，它们的增殖不受影响。结论：ATP对不死化人成纤维细胞的DNA合成有明显的抑制作用。并且使磷酸化细胞膜蛋白的表达增高，其过程中有钙通道和钾通道的参与。     

幽门螺杆菌诱导大鼠胃粘膜细胞分泌胃蛋白酶原

为研究幽门螺杆菌 (Ｈｐ)超声提取物对大鼠胃粘膜细胞系合成与分泌胃蛋白酶原的影响 ,大鼠胃粘膜细胞ＯＵＭＳ 37(34代 )在ＤＭＥＭ培养基中培养 3ｄ后细胞生长到紧密状态时 ,换以新鲜的培养基 ,加入Ｈｐ超声提取物或试剂后 ,采用酸变性法 ,按指定时间取培养上清及细胞裂解液测定胃蛋白酶原活力。结果显示 ,不同浓度的Ｈｐ超声提取物(10 0ｍｇ/Ｌ ,2 0 0ｍｇ/Ｌ ,40 0ｍｇ/Ｌ)对细胞存活无影响。Ｈｐ超声提取物可在 30ｍｉｎ～ 180ｍｉｎ内呈剂量依赖性地诱导大鼠胃细胞分泌胃蛋白酶原。ＤｉｂｕｔｙｒｙｌｃＡＭＰ显著诱导胃粘膜细胞分泌胃…     

HCV core真核表达质粒pcDNA3.1(-)/core的构建

目的构建HCV core基因真核表达质粒,为进一步研究和解析HCV诱发人不死化肝细胞癌化的机制,HCV感染的检测及疫苗和药物研发做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1-3011质粒于大肠杆菌JM109内扩增;提取pBRTM／HCV1-3011质粒;从pBRTM／HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV core片段并将其插入pGEM—T克隆载体;再与表达栽体pcDNA3．1(-)重组,以得到重组的真核表达栽体pcDNA3．1(-)／core;最后限制性酶切鉴定HCV core表达载体。结果从pBRTM／HCV1-3011质粒中扩增出的HCV core片段大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3．1／core内。结论成功的构建了HCV core基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)／core。     

融合基因FADDdel-GFP修饰在胰岛细胞自杀效应中的作用

目的 研究FADDdel-GFP在Fas/FasL介导的胰岛细胞自杀效应中的作用.方法 采用DNA转染技术将重组体pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞);采用FACS检测细胞因子诱导后NIT细胞的Fas和FasL表达情况及细胞自杀效应;采用active caspase3检测试剂盒检测细胞因子作用前后NIT细胞的caspase-3活性变化.结果 NIT细胞表面无Fas和FasL表达,细胞因子可促其表达增加;细胞因子作用后,FADDdel-GFP修饰的NIT细胞的细胞损伤百分率和细胞内caspase3活性明显低于对照组.结论 FADDdel-GFP修饰的NIT细胞具有一定的抵抗Fas/FasL途径介导细胞自杀效应的能力.