改良人原生殖细胞培养基培养日本血吸虫生殖类细胞的初步研究

目的探讨改良人原生殖细胞（human primordial germ cells,HPGC）培养基培养日本血吸虫（Schistosoma ja-ponicum,Sj）生殖类细胞的可行性。方法用HPGC培养基和改良HPGC培养基,分别对日本血吸虫36d成虫全细胞进行选择性培养,比较观察培养细胞的生长特性和一般形态,对2种培养基培养4-6周的细胞进行超微结构和AKP染色鉴定,对改良HPGC培养基培养细胞用BrdU掺入法检测细胞增殖与染色体核型分析。结果HPGC培养基培养2周后出现形态和大小较均匀的细胞,6周时多数细胞死亡或崩解;培养4周的细胞超微结构显示异常形态,APK染色呈阳性反应。改良HPGC培养基培养细胞呈半悬浮集落状态,4周内生长较快,形态差异悬殊,随着培养期延长,细胞呈相似的圆形,核和核仁清晰;培养6周后,细胞生长速度减慢,细胞核逐渐消失,至第10周左右死亡;培养8周内均可见细胞分裂相。BrdU掺入法检测培养4周细胞可见细胞核酸合成;培养5周的细胞超微结构显示正常形态,具生殖类细胞特征（胞质中可见大小不等的囊泡）,细胞染色体核型表现血吸虫单倍体和双倍体特征;培养6周的细胞AKP染色呈强阳性反应。结论用HPGC改良培养基能使日本血吸虫成虫的某些类别的细胞增殖,该类细胞具有生殖类细胞的部分特征。     

南洞庭湖区居民血防知识、卫生行为及相关因素的调查分析

目的进一步了解血吸虫病流行区居民血防知识、卫生行为,探讨有关的因素.方法在南洞庭湖区整群抽取326名居民作血防知识及相关的卫生行为问卷调查.结果受访的居民血防知识评分男女分别为6.34±1.46、6.12±1.55,无显著性差异(P＞0.05);卫生行为评分男女分别为7.93±2.45、9.55±2.57,差异显著(P＜0.01).相关分析显示受访居民血防知识与卫生行为无相关性(P＞0.05),而血防知识与文化程度、家中人口数、治疗次数、家属中患病人数明显相关;居民卫生行为与职业、文化程度、家庭收入、既往病史显著相关;逐步回归分析表明影响居民卫生知识的因素为文化程度和家庭人口数,卫生行为的主要影响因素有职业、文化程度及家庭收入.结论重视血防健康教育、提高居民的自我防护意识应是洞庭湖区血防部门的工作重点之一.     

高脂饮食诱导APOE和LDLR基因敲除鼠AS斑块形成的分子病理学特征

目的 观察在高脂饮食务件下,载脂蛋白E(ApoE)和低度密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)斑块形成的病理学特征与基质金属蛋白酶(MMP-2,9)和Mac-3表达水平.方法 用C57BL/6J小鼠普通饮食作对照,用ApoE基因敲除和LDLR基因敲除两种小鼠,每种分为普通饮食和高脂饮食两组,8只/组.连续喂养120d后,分离获得各组小鼠主动脉,用Masson染色,油红O染色法观察小鼠动脉粥样斑块病理形态学变化,用免疫组织化学检测AS斑块内炎症以及基质金属蛋白酶(MMP-2,9)表达水平,用免疫双荧光抗体法分析AS斑块巨噬细胞和平滑肌细胞内MMP-9表达的差异.结果 与普通饮食的基因敲除鼠比,高脂饮食的ApoE和LDLR基因敲除鼠的动脉粥样硬化斑块显著增大,炎性细胞增多,纤维帽中基质纤维成分减少,纤维帽形状变薄和大量中性脂滴沉积.其中,以ApoE基因敲除鼠的最为严重.AS斑块形成大小与Mac-3表达水平和炎症细胞增加呈正相关.斑块内MMP-9表达在巨噬细胞内占50%～70%,在平滑肌细胞内占30%.结论 高脂饮食可加重ApoE和LDLR基因敲除小鼠AS斑块形成和Mac-3表达及炎症细胞增加,MMPs水平亦相应增加,其病变呈现出不稳定性斑块特征.     

人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的：构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体，并验
证其干扰效果。方法：设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段，在两端和中间加上酶
切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中，经过酶切和测序验证，成功构建人Dp71基
因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells，GES-1)和人
支气管上皮细胞(human bronchial epithelium，HBE)，Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果：酶
切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC，和空白细
胞对照及shRNA空白载体组相比，3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达，但是3组质粒的抑制效率有一定的差
异，以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论：成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA 干
扰载体，3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达，其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

一种分离纯化东方田鼠肝细胞的方法改进

目的 建立体外培养东方田鼠鼠肝细胞的实验体系.方法 采用下腔静脉插管原位灌注结合胶原酶灌注法分离纯化出肝细胞,在改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Earle Media,DMEM)中培养,显微镜下观察细胞形态,AO-EB染色观察测定其活率来评价细胞质量.结果 一只东方田鼠肝脏一般可获得1.5×108～3.0×108个细胞,活率达95%,完全符合实验要求.刚分离的东方田鼠肝细胞呈圆球形,大小均匀,培养3 h后,大部分肝细胞出现贴壁,形态呈扁平状.培养24 h后,伸展良好,并成片生长.结论 下腔静脉插管原位灌注结合胶原酶灌注法可以分离出高纯度和活率高的东方田鼠肝细胞.     

旋毛虫肌蚴可溶性抗原与日本血吸虫抗血清交叉反应的研究

【目的】从分子水平研究旋毛虫诱导抗日本血吸虫保护性免疫。【方法】应用ＥＩＴＢ技术对旋毛虫肌蚴上清抗原与多种日本吸虫抗血清的交叉反应进行分析。【结果】旋毛虫肌蚴抗原与日本吸虫感染血清、抗雄虫家兔血清、抗尾蚴血清、抗成熟卵及未成熟卵血清、抗环卵血清、抗成虫表膜血清及抗ＧＳＴ血清存在广泛交叉反应带。【结论】旋毛虫抗血吸虫抗原具有复杂性，其与血吸虫不同发育阶段、不同组分免疫血清存在交叉反应。     

免疫增强剂与免疫抑制剂对吡喹酮杀血吸虫效果的影响

目的观察中药免疫增强剂和化学免疫抑制剂对吡喹酮杀血吸虫效果的影响. 方法日本血吸虫感染昆明小鼠后随机分成四组,对照组、吡喹酮治疗组、氢化可的松(免疫抑制剂) 吡喹酮治疗组、中药(免疫增强剂) 吡喹酮治疗组,分别采取相应不同的治疗方式,于吡喹酮治疗后2周剖杀小鼠,观察减虫及减卵效果;并于吡喹酮治疗前采血,用ELISA方法测定特异性抗血吸虫成虫抗原(AWA)抗体水平. 结果与对照组相比,吡喹酮治疗组、氢化可的松 吡喹酮治疗组、中药 吡喹酮治疗组减虫率分别为53.22%,35.61%,69.16%;每克肝卵减少率分别为47.08%,31.27%,63.28%.氢化可的松 吡喹酮治疗组、中药 吡喹酮治疗组与吡喹酮治疗组相比,减虫与减卵效果统计学有显著差异(P＜0.05).且各组特异性抗AWA抗体水平高低与减虫、减卵效果相一致. 结论进一步证明吡喹酮杀血吸虫作用具有免疫依赖性,而且证实中药免疫增强剂具有增强宿主特异性免疫应答,提高吡喹酮杀虫效果的作用.     

改良人原生殖细胞培养基培养日本血吸虫生殖类细胞的初步研究

目的 探讨改良人原生殖细胞(human primordial germ cells,HPGC)培养基培养日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)生殖类细胞的可行性.方法 用HPGC培养基和改良HPGC培养基,分别对日本血吸虫36d成虫全细胞进行选择性培养,比较观察培养细胞的生长特性和一般形态,对2种培养基培养4～6周的细胞进行超微结构和AKP染色鉴定,对改良HPGC培养基培养细胞用BrdU掺入法检测细胞增殖与染色体核型分析.结果 HPGC培养基培养2周后出现形态和大小较均匀的细胞,6周时多数细胞死亡或崩解;培养4周的细胞超微结构显示异常形态,APK染色呈阳性反应.改良HPGC培养基培养细胞呈半悬浮集落状态,4周内生长较快,形态差异悬殊,随着培养期延长,细胞呈相似的圆形,核和核仁清晰;培养6周后,细胞生长速度减慢,细胞核逐渐消失,至第10周左右死亡;培养8周内均可见细胞分裂相.BrdU掺入法检测培养4周细胞可见细胞核酸合成;培养5周的细胞超微结构显示正常形态,具生殖类细胞特征(胞质中可见大小不等的囊泡),细胞染色体核型表现血吸虫单倍体和双倍体特征;培养6周的细胞AKP染色呈强阳性反应.结论 用HPGC改良培养基能使日本血吸虫成虫的某些类别的细胞增殖,该类细胞具有生殖类细胞的部分特征.     

日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的应用研究

目的 探讨日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验（F-ELISA）抗体检测试剂盒检测日本血吸虫病的特异性、敏感性及与其他寄生虫病的交叉反应。方法 采用F-ELISA法检测日本血吸虫急性、慢性及晚期病人血清中抗SEA抗体和健康人、并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病患者血清中的交叉抗体。结果 检测急性、慢性及晚期血吸虫病人的敏感性分别为100%、95.19%和77.78%，检测正常人的特异性为98.46%，与并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病人的交叉反应率分别为11.63%、7.55%、0和13.33%。结论 F-ELISA检测日本血吸虫病具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点，具有较高的现场查病和临床诊断血吸虫病的应用价值。     

重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导小鼠保护力的研究

目的 用重组日本血吸虫副肌球蛋白（rSj97)免疫小鼠,观察保护效果。方法 小鼠随机分为3组,免疫组在0、2、15周,皮下注射rSj97加佐剂Quil,同一时间佐剂对照组和空白对照组注射等量QuilA和缓冲液A,第3次免疫后,每鼠经腹部贴片攻击感染50条尾蚴,感染后45d剖杀小鼠,观察其减虫和减卵效果。结果 与缓冲液和QuilA对照组相比,rSj97 QuilA免疫组的减虫率分别为44．1％（P＜0．01）和17．8％（P＜0．05）,每克肝组织虫卵数（LEPG）减少率分别为76．5％（P＜0．01）和16．9％（P＜0．05）,每雌肝组织虫卵数（LEPF）减少率分别为62．2％（P＜0．01）和6．1％（P＜0．05）。结论 rSj97加佐剂QuilA可诱导小鼠产生明显的抗血吸虫攻击感染的保护性免疫力及抗生殖免疫力。