以2-O-单取代羟丙基β-环糊精用于毛细管电泳手性分离添加剂

本文研究了一种新的环糊精衍生物2－O－单取代羟丙基β－环糊精做为毛细管电泳手性分离添加剂时，对3种碱性药物对映体；扑尔敏，麻黄碱，心得安的拆分性能。并与β－环糊精，2．6－O－二甲基β－环糊精，多取代2－O－羟丙基β－环糊精的手性识别性能做了对比。     

近期色谱研究亮点

1一种高灵敏的微流芯片电泳的检测方法 发展高灵敏的微流芯片电泳检测技术一直是人们关注的一个焦点。最近,广西师范大学赵书林教授领导的课题组发展了一种基于化学发光共振能量转移(CRET)的高灵敏微流芯片检测方法。他们发现,一些有机化合物(如氨基酸、有机酸、甾体、生物胺和有机硫化物)会抑制鲁米诺和CdTe量子点之间的共振能量转移,从而降低样品区带内的荧光,产生类似间接荧光检测的倒置的电泳谱图。相比于电化学和激光诱导荧光检测,他们发展的检测方法具有操作更简单、灵敏度更高(提高10到1000倍)、通用性更好等特点,且不需要荧光标记。该方法的检测灵敏度可以满足单个血红细胞中9种氨基酸的检测。详见:Anal Chem, 2010, 82: 2036－2041。 2黄蜂蜘蛛性外激素的气相色谱-质谱(GC-MS)鉴定 色谱在生命科学研究中起着越来越重要的作用,对昆虫性外激素的研究即是一例。昆虫性外激素大多数是几种小分子有机化合物组成的混合物。昆虫在交配季节会释放特定组成和含量的性外激素,诱导异性前来约会。不同种类的昆虫之间从不会出现信息传递和解读的错误。这非常类似于人类发明的通讯密码。这种现象使科学家感到非常困惑。最近,德国的两个科学家Gabriel Uhl和Stefan Schulz领导的研究团队合作借助于顶空采样技术和GC-MS技术揭开了黄蜂蜘蛛的性外激素的秘密。他们将雌性的蜘蛛放在玻璃盒内,用活性炭作为吸附剂富集黄蜂蜘蛛在未成熟期、处女期和交尾后3个阶段所释放的挥发性化学物质,用GC-MS分析经二氯甲烷洗脱富集的挥发性物质。对比蜘蛛在这3个阶段所释放出的挥发性物质,他们推测蜘蛛在处女期强烈释放出的化合物A,即甲基柠檬酸三甲酯,很可能就是性外激素。进一步的分析表明化合物A实际上是按照一定比例组成的甲基柠檬酸三甲酯的两个非对映异构体。他们用手性GC柱确定了这两个非对映异构体的绝对构象为2R, 3S和2S, 3S。进一步由不对称合成得到了2R, 3S和2S, 3S这两个异构体,并按6∶1的比例配制成人工的性外激素,结果在野外成功地诱捕到了雄性的黄蜂蜘蛛。这一研究为昆虫性外激素的研究提供了一条有效的途径。详见:Angew Chem Int Ed, 2010, 49: 2033－2036。 3薄层色谱(TLC)的新故事 尽管高效液相色谱风行天下,但作为经典色谱技术之一的薄层色谱仍然被作为一种非常简便、廉价的分离分析工具而受到有机化学家的青睐。事实上,薄层色谱技术的发展并非停止不前,超薄层色谱(ultra-thin-layer chromatography, UTLC)的出现即是一例。UTLC能在只有10 μm厚的整体硅胶层上实现快速高效的分离,在结构上非常容易实现二维分离,或与基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)联用。但是,用常规的薄层扫描色谱仪的点样器很难点出足够小的样品点以实现高的分离效率;另外,由于超薄层板是半透明的,如果点样的斑点太小,则又很难被薄层色谱检测器检测。最近,德国和加拿大科学家合作发表的论文讲述了他们是如何利用办公室喷墨打印机和扫描仪很好地解决UTLC的点样和检测的问题。他们使用一台能够在CD盘上打印的佳能Bubble Jet打印机,将混合的食品色素溶液放入空的打印墨盒中,用绘画软件画好设定大小的斑点,由喷墨打印机将斑点打印到UTLC板上;拿出点好样的薄层板,在普通的TLC仪器上展开后,板面朝下放入扫描仪中,通过扫描仪的扫描就可以方便地检测分离结果。实验结果表明,用喷墨打印机和扫描仪在点样精度和检测灵敏度方面大大优于常规的薄层色谱扫描仪的电喷嘴和影像系统。详见:Anal Chem, Publication Date (Web): February 15, 2010, DOI: 10.1021/ac902945t。 另一篇关于在薄层板上实现快速二维色谱分离工作的论文是由加州大学伯克利分校的Svec教授和北京大学的刘虎威教授课题组合作完成的。他们在4.0 cm×3.3 cm的玻璃板上通过光引发聚合制成50 μm厚的整块的超疏水性聚合物层。通过在聚合前遮挡一小部分的光照,就可以在玻璃板上预留一个600 μm宽的通道。以2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸作为单体,通过光接枝聚合法修饰这一通道后,就能用来做第一维的离子交换色谱分离。由于巨大的表面张力差异,水相流动相被限定在第一维通道内,而整体超疏水性聚合物层可以作为第二维反相色谱的分离介质。他们用一组多肽混合物验证了这一快速二维分离设想的实用性。实验中,研究者采用了紫外光可视化和解吸电喷雾离子化-质谱两种检测技术。这样的实验设计为多维薄层色谱分离技术的发展提供了新思路。详见:Anal Chem, 2010, 82: 2520－2528。 4高通量的top-down蛋白质鉴定方法 在蛋白质组学研究中,有两种方法被用来鉴定复杂的混合蛋白质样品。一种方法是bottom-up(自下而上)方法,即先用蛋白质水解酶将蛋白质混合物消解成混合的多肽片段,再采用液相色谱-串联质谱分析;另一种方法是top-down(自上而下)方法,该方法不需要用酶水解蛋白质,可直接采用质谱裂解技术鉴定出完整的蛋白质结构。前一种方法已经被广为使用,但第二种方法由于缺少能够分离和检测完整蛋白质的高通量技术而仍然处于发展的初期。最近,Illinois大学的Neil Kelleher及其同事提供了一种基于纳升级液相色谱-质谱(nano-LC-MS)的高通量鉴定完整蛋白质的top-down方法。首先,他们建立了全蛋白质的nano-LC-MS线性离子阱质谱分离测定方法。他们发现,使用聚苯乙烯柱可以在0.3 pmol水平上分辨出用来测试的所有的7种蛋白质,而使用硅胶C4柱只能分辨出其中的4种蛋 白质。使用聚苯乙烯柱分离蛋白质获得的质谱检测的信噪比是反相硅胶柱的2～3倍。作者还发现聚苯乙烯填料的孔径大小会显著影响全蛋白质的分离效果。相对于小孔径的填料,孔径为100 nm (1000 )的聚苯乙烯填料能够使相对分子质量(Mr)分布范围很宽的蛋白质获得更好的分离,得到更高的柱效。由于线性离子阱质谱具有更快的扫描速度和更高的信噪比,因此作者选用离子阱质谱而非傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)来进行蛋白质的Mr测定。由于在离子阱内无法选择Mr巨大的蛋白质的电荷状态,也就无法采用碰撞诱发的裂解碎片化方式。因此,作者采用NSD(Nozzle-Skimmer Dissociation)碎片化技术使蛋白质裂解,从而获得高分辨的蛋白质碎片的质谱结果。为了能够用于实际样品中蛋白质的测定,研究者采用8通道的GELFrEETM系统对从酵母细胞或人HeLa S3细胞中提取的蛋白质混合物进行预分离,从而将Mr为10000到100000的蛋白质分成了32个组分,然后采用建立好的nano-LC-MS方法对不同Mr范围的蛋白质组分进行分析测定。另外,还可以采用二维电泳获得更高分离度的预分离。研究者相信他们的技术可以达到与bottom-up方法相当的分析通量。这一工作展示了全蛋白质高通量鉴定的可行性。详见:Anal Chem, 2010, 82: 1234-1244。     

邻苯二甲酸为背景吸收电解质的毛细管电泳法测定低分子量肝素中的阴离子

在生产和贮存低分子量肝素的过程中,糖链上的硫酸酯基团会被水解而损失活性,因此肝素样品中常可以检测到游离的硫酸根离子,此外在生产过程中还会引入其他阴离子。为了检测低分子量肝素的质量稳定性,常用离子色谱检测低分子量肝素中游离的阴离子。但是相对分子质量较大的低分子量肝素会污染离子色谱柱和抑制器。为此发展了一种灵敏的毛细管电泳方法用于测定低分子量肝素中游离的SO~(2-)_4、Cl~-、F~-、PO~(3-)_4和OAc~-。不同于常用的背景吸收离子铬酸根,采用邻苯二甲酸根作为背景吸收电解质。与铬酸根相比,邻苯二甲酸根与所有待测阴离子电泳淌度匹配得更好,因此可以获得较窄的峰形。而且邻苯二甲酸根在230 nm检测波长下的摩尔吸光系数(4 754 L/(mol·cm))比铬酸根(254 nm,2 400 L/(mol·cm))高。因此,可以将毛细管电泳检测阴离子的灵敏度提高到与离子色谱法相当的水平。通过验证,该方法在0.002~1 mmol/L的浓度范围内具有较好的线性关系,日内(n=6)和日间(n=3)迁移时间和峰面积的相对标准偏差均小于3%。所测阴离子的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为0.4~0.8μmol/L和2~4μmol/L。该方法可用于监测低分子量肝素的稳定性。     

毛细管电泳-激光诱导荧光用于中药制剂中氨基酸成分的分析

建立了一种用于测定中药制剂中氨基酸成分的毛细管电泳-荧光检测方法. 用含有α-环糊精(α-CD)的硼砂缓冲溶液为背景电解质, 经异硫氰酸荧光素(FITC)衍生的5种氨基酸在50 min内可以得到很好的分离和测定. 考查了各个分离参数对分离的影响, 得到的优化条件为: 含45 mmol/L的α-环糊精的80 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH值9.2)作为背景电解质, 分离电压20 kV; 柱温22 ℃. 衍生试剂FITC与单个氨基酸的化学计量比为4∶1时, 能够获得稳定荧光强度的氨基酸衍生物. 在优化条件下, 各氨基酸成分在73.5～2900 nmol/L 的浓度范围内呈良好的线性关系(相关系数r2为0.9906～0.9998). 保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.8%～3.0%和0.7%～5.7%, 检测限(3倍信噪比)为3.5～35 nmol/L. 该方法准确可靠, 可用于质量控制为目的的中药制剂中氨基酸成分的定量测定.     

对萘普生和萘普生甲酯的毛细管电泳手性分离

以磺化β－ＣＤ作为手性分离添加剂,分别对萘普生和萘普生甲酯进行了手性分离研究,当磺化β－ＣＤ的浓度为３．５％（Ｗ／Ｖ）时,萘普生和萘普生甲酯的手性分离度都可大于２,但萘普生与萘普生甲酯不能达到同时拆分。如果同时以磺化β－ＣＤ和ＨＰ－β－ＣＤ作为作为手性分离添加剂,则可对萘普生甲酯达到同时拆分,当磺化β－ＣＤ和ＨＰ－β－ＣＤ的浓度分别为３．５％和１．５％（Ｗ／Ｖ）时,对萘磺生和萘普生甲酯两种消旋体的     

聚乙类吡咯烷酮动态涂敷毛细管电泳柱分离碱性蛋白质

以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）为添加剂对毛细管柱进行动态修饰,用于碱性蛋白分离。对４种碱性蛋白质进行分离,实验结果表明聚乙烯吡咯烷酮能够很了地抑制电不渗流（ＥＯＦ）及碱性蛋白在石英毛细管壁上的吸附作用。在ｐＨ４．０,ＰＶＰ浓度（Ｗ／Ｖ）为０．４％时,ＥＯＦ仅为１．３５×１０＾－９ｍ＾２／Ｖ．ｓ,平均柱效可达５×１０＾５理论塔板数／ｍ。每次运行之间（ｎ＝６）,天与天之间（ｎ＝６）,迁移时间的相对标准偏差     

交联键合型聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的快速制备及评价

建立了一种简单快速制备交联键合聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳柱的方法。在这一方法中,未经处理的毛细管柱直接用含有一定比例的丙烯酰胺、交联剂甲叉基双丙烯酰胺、硅烷化试剂乙烯基三乙氧基硅氧烷以及引发剂偶氮二异丁氰的丙酮溶液进行动态涂渍,再经热处理使单体的交联和聚合物在毛细管壁上的键合反应同时发生。所制柱能够有效地抑制电渗流和蛋白质在毛细管壁上的吸附。碱性蛋白在ｐＨ４．０的缓冲液中分离时,获得的平均分离柱效为     

穴醚［2．2．2］的HgCl_2，CdCl_2及Cd（NO_3）_2配合物的红外

本文合成了穴醚［２．２．２］的ＨｇＣｌ２，ＣｄＣｌ２及Ｃｄ（ＮＯ３）２配合物，用元素分析数据确定了它们的化学组成，并对其红外和拉曼光谱进行了经验归属。基于这两组数据推测了配合物的结构。     

二烯丙基聚乙二醇20M交联键合型毛细管电泳柱的制备及其评价

本将聚乙二醇２０Ｍ改性为二烯丙基聚乙二醇２０Ｍ，使其更容易在毛细管壁进行，交联和键合，采用超动态涂柱技术，实现了快速制备二烯丙基聚乙二醇２０Ｍ交联键合型毛细管电泳柱，该制柱方法具有简单，速度快，制柱重复性高的特点，用四种碱性蛋白对所制的柱进行评价，平均柱效可达５×１０＾５理论塔板数／米，每次运行之间（Ｎ＝６），天与天之间（Ｎ＝３），以及柱与柱之间（Ｎ＝３）的迁移时间的标准偏差（ＲＳＤ％）在０．２     

伴刀豆凝集素修饰磁性纳米粒子富集人血清中糖蛋白及质谱鉴定

发展了一种新型的磁性纳米粒子应用于人血清中特异性糖蛋白的亲和富集。制备的磁性纳米粒子具有核/壳/壳结构,即由Fe₃O₄磁性粒子/硅胶层/有机聚合物外层构成。伴刀豆凝集素A（Con A）以共价键合的形式通过短链聚乙二醇固定在粒子表面,实现了人血清中特异性糖蛋白的高效富集。富集的蛋白经过胰蛋白酶酶解后,所得的肽段经离线的二维色谱分离,用高分辨质谱共鉴定出80种蛋白。通过NetNGlyc等搜索软件分析确定其中76种为糖蛋白,分析发现在血清中质量浓度仅为0.00001 g/L的 β -2-glycoprotein 1也得到了鉴定,表明我们发展的磁性纳米粒子与凝集素相结合的方式,可以高效地富集复杂体系中与主要蛋白成分含量相差12个数量级的低丰度糖蛋白。