建立一种快速检测坂歧肠杆菌的方法

目的:建立快速检测婴儿配方奶制品(IFM)中坂歧肠杆菌的方法。方法:选择ATCC坂歧肠杆菌标准株,对不同的增菌性培养基、选择性培养基和显色培养基进行研究;结合VITEK仪和API20E细菌鉴定系统,构建快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法。结果:建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法,所需检验流程为72h,方法灵敏度为2CUF/g,能有效区别于阴沟杆菌、产气杆菌等肠杆菌科细菌;方法应用稳定;操作简单、方法可靠,适宜规模化检测。结论:本研究认为,所建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法适宜检验检疫的工作要求,能有效地发现配方奶制品中坂歧肠杆菌的污染情况。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

五种DNA提取方法对酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比较

针对酸奶及菌粉样品,比较多种样品前处理条件,包括取样量、菌粉溶剂及溶菌酶孵育时间等,最大程度去除样品中的脂肪、蛋白质及多糖,比较五种DNA提取试剂盒对益生菌DNA的提取效果。提取的DNA经Nano Vue Plus测定浓度和纯度,PCR扩增综合评价提取效果。结果显示,酸奶取样量为100 mg时DNA浓度为49.00 ng/μL,A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.8;采用纯牛奶溶解菌粉更为彻底,0.5 g/m L牛奶溶解菌粉后,提取DNA浓度可达到81.00 ng/μL;溶菌酶最佳孵育时间为1 h,增加孵育时间对细菌裂解没有明显帮助。同时,采用五种试剂盒所提取的DNA浓度均在20 ng/μL以上,A₂₆₀/A₂₈₀比值大于1.8或接近1.8,其中,Tiangen试剂盒提取的DNA浓度和纯度综合评价优于其他4种试剂盒。结果表明,实验建立的前处理方法能够有效的去除酸奶及菌粉中的脂肪、蛋白质及多糖,提高DNA提取的浓度及纯度;采用的五种商品化试剂盒均能用于酸奶和菌粉中益生菌DNA快速提取,在步骤、得率及纯度上各有差异,应按照不同的实验要求进行选择。      

食源性沙门氏菌磁性纳米粒子RT-PCR检测方法的研究

建立适合食源性沙门氏菌的RT-PCR 检测体系。根据沙门氏菌的转录起始因子rpoD 设计引物Salmrpod2/5,以rpoD 基因的mRNA 为检测对象,在样品制备时采用新型的磁性纳米粒子分离mRNA 技术,建立快速检测食品中沙门氏菌的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法。结果表明,Salmrpod2/5 引物能有效地将沙门氏菌与其他亲缘关系较近的肠杆菌科细菌区分开来。样品中沙门氏菌添加实验表明,该方法对沙门氏菌的检测下限为10CFU/25ml,检测时间少于18h。该方法具有灵敏、特异、快速的特点,适宜于在食品卫生行业中进行推广及应用。     

重组酶介导扩增技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

目的 建立重组酶介导扩增技术（RAA）快速检测副溶血性弧菌的方法。方法 本研究根据副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus）tlh 基因序列设计特异性引物,经引物筛选,建立副溶血性弧菌的重组酶等温扩增（recombinase aidamplification, RAA）的快速检测方法。结果 该方法在25 ℃-43 ℃条件下,30 min即可观察到检测结果。特异性试验结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌与其他弧菌属菌种不存在交叉反应,灵敏度试验分析结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌检出限为5.3×101 CFU/mL。用100份样品验证RAA方法的可靠性,结果显示RAA方法和传统划线方法结果符合率为100%,表现出高度一致性。结论 本研究建立的RAA检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速等优点,为水产品中副溶血性弧菌的检测提供了新的发展方向。     

多位点序列分析方法在克罗诺杆菌属菌株溯源分析上的应用

克罗诺杆菌(Cronobacter)是一种急性细菌病原体,最初因与新生儿重症监护室爆发的几起致死性疾病(脑膜炎,坏死性小肠结肠炎)相关而受到人们广泛关注。目前Cronobacter PubMLST基因组和序列定义数据库(http://pubmlst.org/cronobacter/)中已包含超过2400多株克罗诺杆菌分离菌株的序列信息,阪崎克罗诺杆菌1 774株,丙二酸盐阳性克罗诺杆菌295株是其中的优势菌种,这些菌株共分离自40多个国家和地区。通过将7个位点的多位点序列分型(7-loci multilocus sequence typing,7-loci MLST)方案应用于2438株克诺罗菌株,共揭示了591种可定义的序列型(sequence type,ST),其中ST4(334株)、ST1(280株)、ST7(78株)和ST13(67株)为主要序列型。7-loci MLST对于克罗诺杆菌的致病型分型鉴定有很大帮助,但由于MLST所针对的七个基因位点在基因组总量中占比较小,导致同一ST型中包含地理来源,分离时间,宿主等不相关的菌株,而对菌株溯源结果适得其反。为了解决这一问题,本研究进一步采用基于直系同源基因簇的多位点序列分析方法(Clusters of Orthologous Genes MLST, cogMLST(1865-loci)),对PubMLST中240株已完成全基因组测序的菌株,包括阪崎克罗诺杆菌ST1(67株),ST4(95株),ST13(43株)和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌ST7(35株)进行了全基因组序列分析。结果显示,cogMLST可对ST型相同,但无相关性的菌株进行进一步分型,且不同聚类与菌株分离国家及来源之间存在一定相关性。这或许对于相同ST克罗诺杆菌属菌株的全球溯源分析及食源性疾病监测有较大帮助。     

重组酶介导的等温扩增结合CRISPR/Cas12a检测志贺氏菌和克罗诺杆菌

目的 应用重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided Amplification,RAA)结合成簇规则的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR),建立志贺氏菌和克罗诺杆菌的快速检测方法。方法 通过筛选志贺氏菌和克罗诺杆菌特异性基因,设计特异扩增引物、CRISPR脱氧核糖核酸(CRISPR Deoxyribonucleic acid,crDNA)和探针,将靶标进行RAA扩增后,建立CRISPR检测方法。对方法的灵敏度、特异性和应用性进行评价,并与国标检测方法进行对比。结果 本方法对志贺氏菌和克罗诺杆菌纯菌液DNA最低检出限分别为4.9×103 CFU/mL、4.4×104 CFU/mL,基因组DNA最低检测限为6.8×10-3 ng/μL、5.7×10-3 ng/μL,特异性好,与其它病原菌无交叉反应。同时,该方法成功检测出加标猪肉样品和人工污染奶粉中的志贺氏菌和克罗诺杆菌,比国标法检测限更低。结论 本研究建立的RAA-CRISPR方法可有效应用于志贺氏菌和克罗诺杆菌的检测,这为快速筛查食品中是否污染这两种病原菌提供重要价值。     

发酵乳制品中乳酸菌的流式检测方案探索与研究

目的 建立基于流式细胞术的发酵乳制品中乳酸菌快速计数方法, 实现发酵乳制品中乳酸菌的快速定量检测。方法 使用5(6)-羧基荧光素二乙酸酯（5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate,cFDA） 和碘化丙啶（Propidium iodid,PI）2种荧光染料对乳酸菌进行染色,经流式细胞仪检测乳酸菌的荧光信号,从而实现细菌定量计数。在分析过程中对染色剂浓度、荧光通道阈值进行优化,并将流式计数结果与现行国标方法进行对比研究。结果 在样品浓度为104 CFU/mL(g)时,通过0.05 μg/mL的PI和10 μmol/L的cFDA染色,在绿色荧光通道增益为100,红色荧光通道增益达到1000时,能够达到最佳的流式检测条件,且样品检测结果与现行国标检测方法存在显著的正相关关系（P<0.01）,2种方法测试结果相关系数值为0.949。结论 流式细胞术具有灵敏度高、检测时间短、稳定性高、重现性好等优点,对于货架期普遍较短,放行压力大的乳制品生产企业来说,能够缩短检测时间,实现产品快速放行上架。     

克罗诺杆菌抑制剂的研究进展

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是一种食源性条件致病菌,可以引起新生儿和婴儿的坏死性小肠结肠炎,菌血症和脑膜炎,死亡率高达80%。因为克罗诺杆菌对婴幼儿、老年人等特定人群危害较大,所以对克罗诺杆菌感染的预防和治疗至关重要。该文介绍一些克罗诺杆菌抑制剂的最新研究进展,包括植物次生代谢物类、有机酸类、益生元、纳米粒子类等。     

克诺罗杆菌检测用单克隆抗体的制备及功效评价

目的:选择克诺罗杆菌标准菌株中的多株代表菌株作为抗原,采用多抗原组合免疫的方法,筛选制备抗克诺罗杆菌属（Cronobacter spp.）检测用单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）,并对获得的抗体进行各项指标评价,为进一步建立克诺罗杆菌免疫学快速检测方法创造条件。方法:采用冻融裂解、超声破碎、全颗粒三种方法制备抗原,以克诺罗杆菌标准菌株及分离菌株20株,9株非克诺罗杆菌进行筛选。筛选获得的抗体鉴定特异性,进行Ig亚类分型,测定效价及相对亲和力常数。结果:获得6株针对克诺罗杆菌的杂交瘤细胞株,腹水效价均在1∶107以上;相对亲和常数均大于1.0×1010L/mol。采用\