单性日本血吸虫成虫感染性小鼠肝纤维化研究北大核心CSCD

目的观察和评估单性日本血吸虫成虫感染小鼠出现肝纤维化病变风险。方法将40只小鼠随机分为双性感染组、单性雄虫组、单性雌虫组和未感染组,每组10只,分别经腹壁皮肤接触感染雌雄尾蚴、雄性尾蚴、雌性尾蚴和不含尾蚴的去氯水,感染尾蚴数为(40±1)条/只。双性感染组小鼠感染周期为6周,其余3组为36周。取小鼠肝脏,观察肝脏大体形态;经HE和Masson染色镜下观察小鼠肝脏病理变化和胶原纤维增生情况;测定肝脏胶原纤维特有的羟脯氨酸含量;应用荧光定量PCR和Western blot检测肝组织α-SMA、TGF-β1、Col1、Col3 mRNA和蛋白表达水平。结果与无感染组比较,单性雄虫组小鼠肝脏颜色发黑,肝组织内有大量色素沉积,周围有炎性细胞浸润,色素沉积处有胶原纤维;单性雌虫组小鼠肝脏大体形态与无感染组相似,病理变化和胶原纤维增生明显轻于单性雄虫组。单性雄虫组、单性雌虫组、双性感染组和未感染组小鼠的肝脏羟脯氨酸含量分别为(0.209±0.033)、(0.187±0.034)、(0.194±0.04)和(0.122±0.016)μg/mg,单性雄虫组、单性雌虫组均显著高于未感染组(P均<0.05),与双性感染组均无明显差异。单性雄虫组小鼠肝脏Col1(2.4±0.91)和α-SMA(0.22±0.1)mRNA表达都明显高于未感染组[Col1(1.05±0.29)、α-SMA(0.08±0.01)](P均<0.05),Col1(2.4±0.91)(P<0.01)和TGF-β1(4.28±2.58)(P<0.05)mRNA表达均显著高于双性感染组;单性雌虫组各基因mRNA表达水平与未感染组相比均无显著差异,Col1(1.34±0.18)和TGF-β1(3.55±1.34)mRNA表达水平也显著高于双性感染组[Col1(0.84±0.14)、TGF-β1(0.31±0.11)、α-SMA(0.36±0.11)、Col3(2.15±0.61)](P均<0.01),α-SMA(0.17±0.11)(P<0.05)和Col3(0.51±0.23)(P<0.01)mRNA表达则显著降低。单性雄虫组小鼠肝脏各基因蛋白表达水平与未感染组比较均无明显差异;单性雌虫组TGF-β1(1.03±0.39)蛋白表达量显著低于未感染组TGF-β1(1.78±0.29)(P<0.05)。结论单性血吸虫成虫会导致小鼠肝脏炎症细胞浸润,胶原纤维增生,羟脯氨酸增加、部分肝纤维化分子指标mRNA表达上调等肝纤维化特征和向肝纤维化演变趋势,并且单性雄虫比单性雌虫更易引发小鼠肝脏病变。     

血吸虫病快速早期诊断试纸条的研究

目的探索一种血吸虫病快速早期诊断的试纸条检测方法.方法用标记胶体染料的可溶性尾蚴抗原(SCA)作为检测抗原,建立用于血吸虫病早期诊断的简便快速的可溶性尾蚴抗原胶体染料试纸条法(SCA-DDIA),并与可溶性虫卵抗原胶体染料试纸条法(SEA-DDIA)比较,检测感染家兔早期血清和急、慢性血吸虫病人血清中抗血吸虫抗体,并检测卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病、姜片虫病人和健康人血清.结果早期感染血吸虫家兔感染后首次检出阳性的平均时间为22 d,全部家兔检出阳性为30 d,均早于SEA-DDIA法.检测急、慢性血吸虫病人的敏感性分别为100.0%、93.3%,检测非血吸虫病流行区健康人的特异性为99.0%,与卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病、姜片虫病人的交叉反应率分别为26.3%、0、0.其敏感性、特异性和交叉反应率与SEA-DDIA法相似.结论 SCA胶体染料试纸条法是一种快速简便的血吸虫病早期诊断方法,并具有较高的敏感性和特异性.     

血吸虫对吡喹酮抗药性的研究Ⅷ曼氏血吸虫吡喹酮抗性株与敏感株对鼠的易感性及其产卵量

目的了解曼氏血吸虫吡喹酮抗性株对终宿主致病作用的强弱.方法采用浸尾法以200尾蚴/鼠逐只感染远交系CD1鼠,感染57 d后采集鼠粪便计数虫卵;78 d后剖杀鼠收集成虫计数并摘取肝脏和肠做组织虫卵计数;95 d后取肝组织,切片、染色测量虫卵肉芽肿面积和周长.比较抗性株与敏感株对终宿主的易感性、产卵量和肝虫卵肉芽肿面积.结果抗性株和敏感株感染鼠成虫回收数为22.5条/鼠和21.8条/鼠;抗性株感染鼠粪便虫卵数为68.6只/100 mg,敏感株为31.7只/100 mg,两者间差异有非常显著性;感染第78天,抗性株组织虫卵数为8 364只/对成虫,敏感株为4 665只/对成虫,两者间差异有非常显著性;敏感株产于肝和肠组织虫卵数为1 540只/对成虫和3 124只/对成虫,抗性株分别为4 297只/对成虫和3 887只/对成虫;抗性株和敏感株感染鼠肝虫卵肉芽肿面积分别为392 236μm2和523 263μm2,周长分别为2 385μm和2 882 μm,两者间差异均无显著性.结论抗性株在粪便与组织中产卵量均高于敏感株,故抗性株对终宿主的致病作用强于敏感株.     

日本血吸虫诱导小鼠肝纤维化进程中TGF-β1和HSP47的作用机制研究

目的　观察在日本血吸虫诱导的小鼠肝纤维化进程中转化生长因子?β1（Transforming growth factor?β1, TGF?β1）和热休克蛋白47（Heat shock protein 47, HSP47）的动态表达,探讨其在日本血吸虫病肝纤维化发生发展中的作用。方法　将50只雌性ICR小鼠随机分成感染组和正常对照组,每组25只。感染组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（20 ± 1）条,对照组以不含尾蚴的去氯水处理。分别于感染后4、6、8、10周和12周等5个时间点,各取5只小鼠肝组织。应用酶联免疫吸附试验检测各小鼠血清中HSP47和TGF?β1含量,肝组织HE染色观察病理学改变,Masson染色观察胶原增生情况,应用实时荧光定量PCR检测肝组织TGF?β1、HSP47、I型胶原（α1）链COL1A1基因mRNA表达水平。结果　在日本血吸虫诱导小鼠肝纤维化过程中,小鼠血清HSP47和TGF?β1浓度和肝组织中TGF?β1 mRNA、HSP47 mRNA、COL1A1 mRNA表达水平均随纤维化进展而渐次升高。小鼠感染后6周,小鼠血清HSP47和TGF?β1含量分别为（179.26 ± 29.87） pg/mL和（22.37 ± 5.21） ng/mL,显著高于同期正常对照组小鼠的（150.29 ± 34.91） pg/mL和（18.54 ± 7.78） ng/mL（P均< 0.05）。肝组织HSP47 mRNA、COL1A1 mRNA、TGF?β1 mRNA表达水平分别为（0.86 ± 0.04）、（1.17 ± 0.06）和（0.64 ± 0.13）,均高于同期正常对照组小鼠的（0.23 ± 0.03）、（0.20 ± 0.02）和（0.38 ± 0.02）（P均< 0.01）。 结论　TGF?β1和HSP47在日本血吸虫诱导的小鼠肝纤维进程中的表达与肝纤维化进程一致,且随I型胶原的增多呈升高趋势;HSP47有望成为日本血吸虫病肝纤维化的新诊断标志物和治疗靶点。     

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA：pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗，重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB／c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组，每组14只。A组为自然感染组；B组（空质粒对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1；C组（空质粒＋混合蛋白对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μl福氏完全佐剂（FCA）；D组（混合DNA组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗；E组（混合DNA＋混合蛋白组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周，蛋白加强组末次免疫后2周，所有小鼠同时经腹部皮肤感染（40±1）条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠，计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血，分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a，并取小鼠脾脏制备单个脾细胞，检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17．70％、32．88％和45．35％，D组和E组的减虫率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率显著高于D组（P〈0．01）；C、D组和E组的减卵率分别为9．39％、36．20％和48．54％，D组和E组的减卵率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率也显著高于D组（P〈0．05）。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，?     

日本血吸虫SjC21.7核酸疫苗诱导小鼠保护性免疫作用的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 1.7k Da膜蛋白分子 (Sj C2 1.7)核酸疫苗对 BAL B/ c小鼠的免疫保护性作用。　方法　采用 PCR方法扩增出特异性 Sj C2 1.7基因的开放阅读框序列 ,在其起始密码子处引入 Kozark序列。将目的基因片段亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3.1中 ,构建重组真核表达质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为对照组、实验组和加强组。对照组小鼠的股四头肌注射接种 pc DNA3.1,实验组同法注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc D-NA3.1,加强组除注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1外 ,同时注射重组质粒 P35 - pc DNA3.1及 P4 0 - pc DNA。每隔 2 wk免疫 1次 ,共免疫 3次。第 3次免疫后第 30天 ,每只鼠感染 4 5± 1条尾蚴 ,4 5 d后剖杀计数各组小鼠成虫数及肝卵数。通过 EL ISA和免疫组化分析观察小鼠免疫学特征的变化。　结果　免疫组化分析显示 ,实验组小鼠股四头肌局部组织有特异性抗原蛋白表达。EL ISA分析表明 ,免疫后实验组和加强组有部分小鼠出现特异性 Ig G抗体。与对照组比较 ,实验组减虫率及减卵率分别为 2 9.9%及 13.8% ,加强组分别为 31.9%及 2 8.0 %。加强组减卵率显著高于实验组(P<0 .0 5 )。　结论　 Sj C2 1.7核酸疫苗能诱导 BAL B/ c小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染     

华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析

目的寻找具有血吸虫病早期诊断价值的组分抗原.方法以感染后不同时间的兔血清,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Western blotting）方法,对日本血吸虫尾蚴、成虫和虫卵中的可溶性抗原的成分进行免疫分析.结果可溶性尾蚴抗原（SCA）94、48、41、40 kDa和38 kDa组分抗原最早出现免疫印迹反应,能被感染后2周兔血清所识别,可被感染后3周兔血清识别的SCA 71、23 kDa组分抗原反应最强.可溶性成虫抗原（AWA）最早出现反应的组分抗原是71、58 kDa,能被感染后3周兔血清所识别.可溶性虫卵抗原（SEA）最早出现反应的组分抗原是270、151、73、69、50 kDa和24 kDa,能被感染后4周兔血清所识别.结论 SCA 94、71、48、41、40、38、23 kDa,AWA 71、58 kDa和SEA 270、151、73、69、50、24 kDa能被急性感染兔血清所识别,是具有潜在早期诊断价值的组分抗原.     

小柴胡汤对体外培养LX-2细胞增殖的影响及机制初探

目的观察小柴胡汤对人肝星状细胞(LX-2细胞)增殖的影响。方法体外培养LX-2细胞,用不同浓度的小柴胡汤(2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%)处理24 h,对照组不做处理。显微镜下观察药物作用后细胞形态改变,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Edu)法检测细胞增殖,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测I型胶原(COL-Ⅰ)mRNA的表达情况。结果对照组细胞,贴壁生长良好,形态未见明显异常。经不同浓度小柴胡汤(2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%)处理24 h后,LX-2细胞均出现皱缩,变圆,界限不清,细胞核固缩等不同程度形态改变,MTT检测显示其增殖抑制率分别为100%、54.9%、41.2%、14.8%、12.4%。经1%、0.5%、0.1%小柴胡汤作用24 h后,Edu法检测LX-2细胞增殖率分别为0.1%、5.3%、10.1%;RT-PCR检测其COL-ⅠmRNA的表达量,与对照组1.04±0.35相比,均显著下降,分别为0.45±0.15(P<0.05)、0.27±0.16(P<0.01)和0.38±0.24(P<0.01)。MTT和Edu结果表明小柴胡汤能够抑制体外培养LX-2细胞的增殖,并呈剂量依赖效应。结论小柴胡汤通过抑制LX-2细胞增殖,并抑制COL-ⅠmRNA的表达,从而发挥抗纤维化活性。     

日本血吸虫SjC23蛋白质疫苗对核酸疫苗免疫增强作用的研究

目的　研究 Sj C2 3蛋白质疫苗对 Sj C2 3DNA疫苗增强小鼠的免疫保护作用的效果。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和 Sj C2 3大亲水片段融合蛋白质 (GST-HD)疫苗。把 48只 BAL B/ c小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (DNA和蛋白质疫苗联合免疫组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白质疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射 5 0 μgGST- HD+5 0 μg CFA1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0 μg pc DNA3.1。各组在末次免疫后 4周每鼠以 45± 2条日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 42 .9%的减虫率和 6 0 .0 %的减卵率 ,均显著高于单独Sj C2 3DNA疫苗组 2 8.1%的减虫率和 37.9%的减卵率 ,及单独蛋白质疫苗组 (GST- HD) 2 3.8%减虫率和 39.5 %的减卵率 (P均 <0 .0 5 )。联合组抗体水平