小分子表面活性剂在胶内酶切增效中的应用

本研究成功地将一种有机小分子表面活性剂RapiGest SF(Waters)用于改进电泳分离的蛋白质的鉴定效率。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的肽质量指纹谱,考察了酶切时间、加入量、加样次序、点靶方法对方法灵敏度、蛋白质鉴定率的影响。RapiGest SF浓度为0.5%~1%,在酶切之前加入可获得更多的肽段峰和更高的鉴定率。本方法考染体系的总灵敏度为332fmol,银染体系为664fmol。比较了RapiGest SF与MALDI-TOF-MS和电喷雾质谱(ESI-MS)兼容性,未观察到明显的负影响。方法操作简便,重复性较好,适合鉴定电泳分离的低丰度蛋白质。     

基于保留时间和质荷比匹配的液相色谱-质谱联用技术用于非标记肽段的差异分析

建立了一种无需化学标记的,基于纳升级毛细管液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术和质谱数据处理的肽段差异分析方法。本方法采用定量差异分析与肽序列鉴定分析分别进行的策略,首先对样品进行质谱全扫描的液质全谱式分析,在全扫描质谱数据中提取肽特征点信息,通过保留时间和质荷比参数匹配不同样品中的共有肽特征点,比较其相对峰强度有无差异。最后对样品中存在丰度差异的肽特征点进行选择性二级质谱分析和序列鉴定,从而实现复杂样品中肽段的差异比较分析。以血浆蛋白酶解混合物为实验对象,考察了本方法用于肽段相对定量分析的重现性以及浓度信号响应曲线等。结果表明:提取的肽特征点峰强度相对标准偏差的中值<22%,肽段离子强度动态范围达3个数量级,在5～1000fmol范围内对肽段定量具有良好线性关系。本方法可用于不同条件样品中具有倍数差异的内源性肽的比较分析。     

二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法解析替考拉宁杂质

建立了二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法（2D-UPLC-Q/TOF-MS）对替考拉宁组分分离和杂质结构解析的分析方法,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定替考拉宁杂质的难题。一维超高效液相色谱以Octadecyl silica （ODS） hypersil色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）进行色谱分离,以3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=9/1 （v/v）为流动相A、3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=3/7 （v/v）为流动相B进行梯度洗脱;二维超高效液相色谱以Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）进行脱盐,以0.01 mol/L甲酸铵（pH 6.0）和乙腈为流动相进行梯度脱盐洗脱。质谱在电喷雾离子源、正离子模式下,采用全信息串联质谱（MS^E）模式采集质谱数据,锥孔气流速50 L/h,锥孔电压60 V,离子源温度120 ℃,雾化气流速900 L/h,雾化气温度500 ℃,毛细管电压2500 V,碰撞能量20~50 eV。根据杂质精确质量数及其二级质谱信息推导其结构,并对替考拉宁主要成分TA_2-2的裂解规律进行了推导,发现了2个母核特征离子;对《欧洲药典》10.0收录的10个组分及22个杂质组分进行二级质谱分析,发现了3个新杂质组分。采用该法既可以使用一维超高效液相色谱根据相对保留时间进行组分准确定位,也可以使用二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱二级质谱信息快速、简便、灵敏地对杂质进行结构鉴定,为替考拉宁的质量控制和工艺优化提供了一种新思路。     

高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用

利用TripleTOF 5600高分辨质谱仪分析牛血清白蛋白等3种蛋白质标准品,研究了质谱离子强度与蛋白质样品相对含量的相关性。蛋白质标准品用胰酶酶切后,稀释成1~1024 fmol/7μL的系列溶液,考察在1~1024 fmol 上样量情况下,肽段的前体离子计数( cps)、蛋白质全部肽段的离子计数之和以及被检出肽段数目与上样量的相关性,以及相同样品在3次平行实验之间这些数值的变化幅度。结果表明。被检出肽段数目与上样量正相关,当cps超过1000时,所有肽段离子强度之和与上样量呈线性关系,但是用最灵敏肽段的离子强度表示更为准确。3次测量同一肽段的最高离子强度通常不会超过最低强度的1.5倍,提示当不同样品中同一蛋白的离子强度相差3倍以上是判断不同样品中相同蛋白质的含量具有差异的可靠阈值。本研究提供了一种利用高分辨率和高扫描速度蛋白质组组学定性数据进行半定量分析的方法,简便、快速,可为相关生物学和医学研究提供参考。     

介孔氧化铁材料快速、高效富集分离磷酸化肽段和蛋白的新方法研究

以0.1μmol/Lβ-casein磷酸化蛋白酶解液为对象,利用在酸性条件下对PO43-能够特异性吸附的氧化铁材料为新载体,对介孔氧化铁材料富集分离磷酸化肽段的孵育液酸含量、孵育液有机溶剂含量和洗脱液选择的条件进行了优化,结果表明:室温条件下,在含有0.1%乙酸和30%乙腈的孵育液中孵育5min后,经1mol/LNH3.H2O溶液的洗脱,介孔氧化铁可有效地将磷酸化肽段从蛋白酶解液中富集分离。本方法也可以选择性地提取α-casein磷酸化蛋白,实现了简单、快速、高效的磷酸化肽段和蛋白的富集分离。同时,通过MALDI-TOF串级质谱分析,成功地完成了在优化条件下分离出的磷酸化肽段磷酸位点的鉴定。     

SDS存在下肌红蛋白在乙炔黑电极上的电化学行为研究

基于十二烷基磺酸钠(SDS)存在下,研究肌红蛋白(Mb)在乙炔黑电极上的电化学行为,建立了一种简便灵敏的肌红蛋白电化学分析方法.采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行分析,SDS能显著提高肌红蛋白在乙炔黑电极上的还原峰电流.在最佳实验条件下,峰电流与肌红蛋白浓度在5.6×10-10 mol/L～2.8×10-7mol/L范围内有良好的线性关系,检出限为4.5×10-10 mol/L.方法用于合成样品中肌红蛋白含量的测定.乙炔黑电极可以作为传感器,用于样品中Mb的舍量测定.     

4-巯基苯硼酸修饰二维二硫化钼纳米复合材料的制备及其用于N-糖肽特异性富集

蛋白质的N-糖基化修饰在多种生物过程中发挥着至关重要的作用，近年来的许多研究证实异常的蛋白质糖基化与多种疾病的发生发展密切相关，表明糖基化蛋白质具有较大的潜力成为新的生物标志物或者药物靶标。在样本的处理过程中，对N-糖基化肽段进行富集分离后再进行质谱分析已经成为糖蛋白质组学分析前的必要步骤。但是，由于复杂生物样本中N-糖基化肽段的丰度低和离子化效率差等问题，通过质谱鉴定N-糖肽仍然是一项艰巨的任务。研究通过将纳米金线（Au）、4-巯基苯硼酸（4-MPB）与超薄二维二硫化钼（2D-MoS₂）进行反应，成功制备了一种用于富集蛋白质N-糖基化肽段的新型功能纳米复合材料（MoS₂/Au/4-MPB）。二硫化钼纳米材料的层状结构可以为反应提供大量的可修饰位点，便于修饰纳米金线；功能基团4-巯基苯基硼酸对N-糖肽具有高度的选择性，可以对生物样品中N-糖基化肽段进行特异性富集。使用标准蛋白人免疫球蛋白G（IgG）和牛血清白蛋白（BSA）胰蛋白酶酶切产物对新型功能纳米材料的N-糖基化肽段的富集性能进行评估，其灵敏度达到5 fmol，选择性达到1：1000。将其用于生物样品中N-糖基化肽段的富集，从50 μg尿液外泌体蛋白胰蛋白酶酶切产物中共富集鉴定出768个N-糖肽，归属于377个蛋白质。这些结果表明该新型功能纳米复合材料对复杂生物样品中N-糖肽的选择富集有着巨大的应用潜力，为糖蛋白质组的研究提供了一种新方法。     

疑似蛇毒液样品的纳升级超高效液相色谱-高分辨质谱分析鉴定

针对5个疑似蛇毒毒液及其沾染样品,基于纳升级超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Nano LC-MS/HRMS）技术,结合尺寸排阻色谱分离,建立了一种蛋白质种类及物种归属的严格鉴定方法。5个样品经尺寸排阻色谱分离后均得到3个洗脱峰,分别冻干后以胰蛋白酶进行溶液内酶解处理并进行液相色谱-高分辨质谱分析鉴定。首先采用全扫描-数据依赖型MS/MS（Full MS/dd MS²）采集模式对样品中的肽段信息进行非靶向采集,依次与Swiss-Prot、蛇亚目（Serpentes）、游蛇科（Colubroidea）、眼镜蛇科（Elapidae）、眼镜蛇亚科（Elapinae）、眼镜蛇属（Naja）蛋白质数据库逐级收缩比对;再筛选符合肽谱匹配度、肽段错误发现率小于1%和特征肽段数目大于等于2的蛋白质,共鉴定到32种蛋白质均来自中华眼镜蛇（Naja atra）,可归属于Naja atra的10个家族,主要为三指毒素、金属蛋白酶、磷脂酶A2等。最后,采用平行反应监测模式选取每种蛋白质的两条特征肽段进行靶向验证,当两条特征肽段均满足“至少75%的y⁺和b⁺离子的Δm/z小于5 ppm”时,方认为鉴定到了样品中的某一蛋白质。最终鉴定出5个样品均含有Naja atra蛇毒。此鉴定方法研究系统、严格,可为蛇毒中毒司法鉴定以及毒药物研究等提供有效的技术支持。     

反相高效液相色谱法测定蟾酥中的3种蟾毒内酯

建立了一种基于毛细管反相液相色谱-串联质谱联用技术和质谱峰强度数据处理的肽段鉴定和相对定量分析方法。该方法无需对样品中的肽进行化学标记,在对样品进行反相色谱分离和串联质谱分析后,将二级质谱扫描数据进行蛋白质数据库搜索,获得所鉴定肽段的序列、保留时间、质荷比、带电荷数等定性信息;再以此为定位依据,在全扫描质谱数据中提取该肽段对应的离子峰并以该离子峰的峰强度作为定量信息,从而实现对不同样品中的共有肽段进行差异比较分析。以标准蛋白酶解混合肽段为实验对象,以肽段相对强度的相对标准偏差为指标,考察了该方法用于肽段相对定量分析的重现性、检测动态范围以及浓度标准曲线等,为将该方法用于生物样品中内源性肽的差异分析奠定了基础。。     

毛细管反相液相色谱-串联质谱用于肽的鉴定和相对定量分析

建立了一种基于毛细管反相液相色谱-串联质谱联用技术和质谱峰强度数据处理的肽段鉴定和相对定量分析方法。该方法无需对样品中的肽进行化学标记,在对样品进行反相色谱分离和串联质谱分析后,将二级质谱扫描数据进行蛋白质数据库搜索,获得所鉴定肽段的序列、保留时间、质荷比、带电荷数等定性信息;再以此为定位依据,在全扫描质谱数据中提取该肽段对应的离子峰并以该离子峰的峰强度作为定量信息,从而实现对不同样品中的共有肽段进行差异比较分析。以标准蛋白酶解混合肽段为实验对象,以肽段相对强度的相对标准偏差为指标,考察了该方法用于肽段相对定量分析的重现性、检测动态范围以及浓度标准曲线等,为将该方法用于生物样品中内源性肽的差异分析奠定了基础。     

Monitoring myoglobin by capillary zone electrophoresis with end-column amperometric detection

Capillary zone electrophoresis was employed for the determination of myoglobin in human urine using end-column amperometric detection with a carbon fiber microelectrode at a constant potential of 1.80 V vs. saturated calomel electrode (SCF). The optimum conditions of separation and detection are: 3.73 x 10-4 mol/L sodium diethyl malonyl urea (barbitone sodium), 1.34 x 10-4 mol/L HCl for the buffer solution, 20 kV for separation voltage, 5 kV and 5 s for injection voltage and injection time, respectively. The limit of detection is 4.4 x 10-8 mol/L or 84 amole signal to noise (S/N = 2). The relative standard deviation is 2.9% for the migration time and 2.5% for the electrophoretic peak current. The method can be used for the determination of myoglobin in human urine. The samples can be directly injected and need no pretreatment. The method is also rapid, less than 2 min, and has a recovery rate of 94-106%.     

基于纳米CeO_2增敏鲁米诺化学发光法测定对乙酰氨基酚的研究

基于碱性条件下,CeO_2纳米粒子能够有效增敏鲁米诺-KMnO_4体系的化学发光,并结合流动注射技术建立了一种对乙酰氨基酚测定的新方法。实验研究了影响化学发光检测信号的多种因素,并初步探讨了可能的化学发光机理。在最佳实验条件下,对乙酰氨基酚浓度在1.0×10-7~5.0×10-5mol/L范围内与相对化学发光强度的抑制值呈良好的线性相关,相关系数(r2)为0.996 4,检出限(3σ)为3.3×10-8mol/L。对5.0×10-6mol/L的对乙酰氨基酚溶液平行测定11次,计算得相对标准偏差(RSD)为0.3%。该法用于银翘片中对乙酰氨基酚含量的测定,回收率为98.0%;对尿液的加标回收率为97.9%~98.7%,结果满意。     

镍纳米粒子-离子液体修饰碳糊电极的制备及其对多巴胺的测定

制备了镍纳米粒子-离子液体修饰电极,在0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.0)中研究了多巴胺(DA)在修饰电极上的电化学行为.与裸电极相比,DA在该修饰电极上的氧化还原电位明显降低,氧化还原反应的峰电流明显增大,DA的峰电流与其浓度在2.0×10~(-8) ～1.0×10~(-4) mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为6.5×10~(-9) mol/L.该修饰电极对抗坏血酸具有明显的抗干扰能力.     

Improved detection limits for electrospray ionization on a magnetic sector mass spectrometer by using an array detector

Array detection was compared with point detection for solutions of hen egg-white lysozyme, equine myoglobin, and ubiquitin analyzed by electrospray ionization with a magnetic sector mass spectrometer. The detection limits for samples analyzed by using the array detector system were at least 10 times lower than could be achieved by using a point detector on the same mass spectrometer. The minimum detectable quantity of protein corresponded to a signal-to-background ratio of approximately 2∶1 for a 500 amol/μL solution of hen egg-white lysozyme. However, the ultimate practical sample concentrations appeared to be in the 10–100 fmol/μL range for the analysis of dilute solutions of relatively pure proteins or simple mixtures.     

青霉素酶-氧化苏木精修饰Au/ZnO/石墨烯基青霉素电化学传感器的研制

采用均匀沉淀法合成ZnO纳米颗粒( ZnO NPs),以ZnO NPs为种子,制备水溶性Au/ZnO异质结构。将Au/ZnO异质结构附着于离子液体功能化石墨烯( GN)复合膜上,形成一种新颖的负载型石墨烯复合材料(Au/ZnO/GN)。所构建的青霉素酶-氧化苏木精修饰Au/ZnO/GN(PH-AZG)传感器在PBS水溶液(pH=7.0)中对青霉素钠检测线性范围为2.5×10-14~3.3×10-6 mol/L,检出限达到1.5×10-14 mol/L (S/N≥3)。在相同条件下制备5根PH-AZG电极,其响应电流的相对标准偏差(RSD)小于3.2%。同时,在实际牛奶制品中,本方法的检测线性范围为5×10-14~5×10-7 mol/L,加标回收率为99.7%~101.4%,RSD 为2.3%~3.5%(n=5)。结果表明,本方法对实际牛奶制品中低浓度青霉素钠的检测具有可行性。     

纳米氧化铜-碳纳米管修饰玻碳电极同时检测邻、对苯二酚

以商品化纳米氧化铜和羧化碳纳米管作为玻碳电极修饰材料,结合了两种材料的放大电信号和电催化性能,所构建的复合物修饰电极可区分性质相近的同分异构体邻苯二酚和对苯二酚的信号,同时可进一步放大两种酚的峰电流。 因此该基于纳米氧化铜和碳纳米管的电化学传感器可用于邻苯二酚和对苯二酚的同时检测。 采用循环伏安法对复合物中两种材料的比例、修饰量以及支持电解质pH进行了优化:纳米氧化铜和碳纳米管质量比为5∶1,修饰量为9 μL,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液被用作电解质溶液。 在优化的条件下,邻苯二酚和对苯二酚的微分脉冲伏安扫描峰电流与浓度在6.0×10^-7~3.0×10^-3 mol/L范围内均呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)分别为1.0×10^-7和1.6×10^-7 mol/L。 该方法具有成本低、操作简便、快速的特点,对实际水样的加标回收率在94.6%~101.1%范围内,具有较好的实际应用前景。     

磁性量子点电致化学发光法测定李氏禾提取液中的过氧化氢

利用巯基乙酸水热法合成出表面修饰—COOH的CdTe量子点,并将CdTe量子点(QDs)连接在Fe3O4纳米粒子表面,制备出CdTe/Fe3O4磁性量子点。通过磁力将磁性量子点修饰于石墨电极表面。在pH7.5的PBS缓冲溶液中,H2O2可使CdTe量子点产生电致化学发光,H2O2浓度在4～100μmol/L范围内与CdTe量子点的电致化学发光强度呈良好的线性关系,检出限为0.24μmol/L。据此建立了测定样品中过氧化氢含量的电致化学发光分析法,并成功地应用于李氏禾草汁原液中过氧化氢含量的测定。该研究借助纳米Fe3O4的磁力特征,使敏感膜易于形成和更新分离,简化了实验操作,同时起到增强发光强度的作用。     

胶束电动毛细管色谱安培检测中药马齿苋中多巴胺和去甲肾上腺素

建立了胶束电动毛细管色谱结合电化学安培检测同时分析中药马齿苋中多巴胺和去甲肾上腺素的方法。考察了缓冲液的浓度、pH值、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度以及工作电极电势对分离检测的影响。在优化的条件下,多巴胺和去甲肾上腺素在1.0×10-6～5 0×10-4mol/L范围内有良好线性,浓度检测限(S/N=3)分别为8 7×10-7mol/L和4 2×10-7mol/L,质量检测限分别为1 45fmol和0 41fmol。该方法组分定性可靠,不需要衍生处理,选择性好。将该法应用于中药马齿苋样品的分析,获得了较好的结果。     

核酸适配体封盖的介孔二氧化硅纳米颗粒用于肌红蛋白的检测

利用核酸适配体封盖的介孔二氧化硅纳米颗粒构建了一种新型、 简便及免标记的肌红蛋白定量检测方法. 首先, 用肌红蛋白核酸适配体将荧光小分子罗丹明6G封盖在介孔颗粒内, 当存在目标物肌红蛋白时, 由于介孔颗粒上的核酸适配体可特异性结合肌红蛋白而脱离介孔颗粒表面, 进而释放介孔颗粒内的罗丹明6G, 使溶液荧光强度增强. 实验结果表明, 荧光强度与肌红蛋白的浓度呈正相关, 通过荧光强度的变化可实现对肌红蛋白的定量检测. 该方法的检出限低至1.1 nmol/L, 且选择性好, 可满足临床医学的检测要求.     

Sensitive and selective determination of glucose in human serum and urine based on the peroxyoxalate chemiluminescence reaction of a new fluorophore

A novel method for simple and sensitive determination of glucose based on the peroxyoxalate chemiluminescence (PO-CL) detection of enzymatically generated H(2)O(2) was investigated. Influence of various experimental parameters on glucose sensing, including the action time of the enzyme, solution pH, interferents and the concentration of CL reagents was investigated. Under the optimum condition, the linear response range of glucose was found to be 2.50×10(-6) to 1.75×10(-4) mol/L, and the detection limit (defined as the concentration that could be detected at the signal-to-noise ratio of 3) was 1.10×10(-6) mol/L. The present method has been used to determine the glucose concentrations in real serum and urine samples with satisfactory results.