蒺藜苜蓿MtCKX基因功能的初步鉴定

采用RT-PCR法克隆了蒺藜苜蓿MtCKX基因,基因编码区长1635bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码的蛋白与其他物种CKX蛋白具有较高的同源性,与鹰嘴豆的同源性最高。荧光定量分析结果表明,MtCKX基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。此外,MtCKX基因还响应IAA、6-BA的诱导。成功构建了35S::MtCKX:YFP植物表达载体,亚细胞定位分析表明,MtCKX定位于细胞膜和细胞核。过表达的蒺藜苜蓿MtCKX基因可导致转基因拟南芥中细胞分裂素含量显著降低。     

蒺藜苜蓿全基因组中U-box基因家族的筛选与特征分析

植物基因组中广泛存在U-box基因,其编码蛋白大部分作为泛素系统中决定底物特异性识别的E₃泛素连接酶,广泛地调控植物生长生殖发育以及响应逆境胁迫等过程。本文利用蒺藜苜蓿基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定蒺藜苜蓿U-box家族基因;采用MEGA6软件进行系统进化树分析;通过GSDS在线工具和Mapinspect软件进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的蒺藜苜蓿芯片数据进行组织表达和胁迫响应表达分析。结果表明,蒺藜苜蓿基因组中含有41个U-box基因,不均匀地分布于蒺藜苜蓿的8条染色体上。根据结构域组成和系统进化分析将这些U-box蛋白分成6类。基因表达模式分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性,并能响应盐、干旱和氮素胁迫。这些研究结果为蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基础。     

干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析

水分胁迫是植物面临的最主要的非生物胁迫之一,研究植物的抗旱机理以提高植物的抗旱能力具有重大的意义。抑制性差减杂交是一种筛选特异表达基因的良好手段,使用该方法成功构建了豆科植物黄花苜蓿和蒺藜苜蓿2个差减文库并进行测序。通过GO分类和KEGG分析等手段对文库中序列进行分类,并分析表达序列的差异,发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外,还对筛选到的2个基因在2种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析,结果表明,在黄花苜蓿中这2个基因的表达更加有利于响应和抵抗干旱。这些结果在分子层面上一定程度的解释了黄花苜蓿较蒺藜苜蓿更加抗旱的原因。     

MADS-box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因组分析

MADS-box基因家族是植物体内的重要转录因子,它们广泛地调控着植物生长、发育和生殖等过程。本研究以蒺藜苜蓿基因组数据为材料,采用结构域搜索方法,鉴定了138个MADS-box基因。通过序列比对系统进化分析,将它们分成两大类:Ⅰ型(92个)和Ⅱ型(46个)。同时,通过染色体定位分析发现,134个MADS-box基因定位在染色体上,还有4个MADS-box基因定位在尚未完成最终拼接的超长片段上。蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族成员之间存在大量的基因重复,特别是Ⅰ型MADS-box基因,通过基因复制,MADS-box基因家族在染色体上形成多个密集的MADS-box基因簇。对蒺藜苜蓿的RNA-seq表达谱数据分析,发现MADS-box基因在心皮组织、花器官等组织中表达量较高,这表明蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族广泛地参与苜蓿组织分化、发育以及生殖等过程的调控,这将为进一步揭示MADS-box类转录因子在蒺藜苜蓿中作用机制提供了重要的参考。     

蒺藜苜蓿E3泛素连接酶U-box基因克隆及表达分析

泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用,E3泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别,其中U-box结构的E3泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能,并在抗逆性方面发挥作用。目前,关于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,该基因cDNA全长2448bp,编码815个氨基酸,包括1个U-box结构(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5个ARM结构域,属于U-box/ARM类型E3泛素连接酶。构建原核表达载体pET-MtPUB4,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在大肠杆菌中表达了MtPUB4蛋白。荧光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高,在根中表达量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脱落酸诱导,随着诱导时间增加,表达量呈现出增长趋势。这些结果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用,但在低温胁迫中表达量稍微下降,变化不明显。本研究成功构建了pBI121-MtPUB4植物表达载体,为进一步转化拟南芥突变体Atpub4奠定了基础。     

蒺藜苜蓿SOC1基因克隆及转化

以蒺藜苜蓿R108品种为材料,用PCR技术在蒺藜苜蓿中克隆在整合光周期和春化途径中具有重要作用的基因SOC1,构建3302Y-SOC1植物表达载体,并通过农杆菌介导法成功转入到蒺藜苜蓿中。在遗传转化过程,培养基中加入5mg/L 2,4-D与1mg/L KT获得大量抗性愈伤组织,加入1g/L PVP后使诱导过程中愈伤组织的褐化率降低至23.4%。PCR结果显示,最终获得30株转基因植株,转化率达63.8%,为后续进行SOC1相关基因的研究提供了材料基础。     

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因组分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一类在种子胚胎发育后期特异表达并受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)LEA基因家族进行分析,并对其进化、基因结构、进化压力、染色体定位及基因表达模式进行了系统分析。本研究共筛选出23个蒺藜苜蓿LEA家族基因,可分为8个亚家族。基因定位结果表明,23个蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6号染色体外的其他7条染色体上,但分布不均匀;家族成员外显子数目都不超过两个,结构简单。不同组织表达谱分析结果显示,LEA家族基因具有不同的组织表达模式,并受干旱逆境胁迫调控。本研究结果可为蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基础。     

蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆与功能分析

核干因子(NS)是一类广泛存在于动物细胞核中的GTP结合蛋白,主要参与胚的形成和细胞增殖,对维持细胞周期具有重要作用。本研究旨在初探蒺藜苜蓿MtNSN1的表达模式及其对生长发育的调控功能。克隆获得蒺藜苜蓿MtNSN1基因cDNA全长2193bp,其中开放阅读框为1800bp,编码599个氨基酸,蛋白分子量133.7kDa。进化树分析显示MtNSN1与大豆NSN1的氨基酸同源性为66.67%。组织器官表达分析表明,MtNSN1在蒺藜苜蓿花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低。RNA原位杂交的结果显示该基因主要在蒺藜苜蓿生长发育活跃的茎尖分生组织及其周围的幼嫩叶中表达。MtNSN1转化野生型拟南芥得到超表达植株,通过统计分析表明超表达植株的主根长度和叶片数量都明显优于野生型。在超表达植株中5个细胞周期标记基因的表达水平均比野生型拟南芥显著上调;利用DNA化学诱变剂博来霉素对植株进行处理,发现超表达植株的根系受抑制程度小于野生型。以上结果表明,MtNSN1与蒺藜苜蓿茎尖分生组织的维持及地上、地下器官的发育有关,同时异源表达MtNSN1在转录水平上影响拟南芥细胞周期的表达。     

蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因组鉴定、表达和功能分析

脱落酸(ABA)是一种内源性激素,在调节植物的生长发育、非生物胁迫和生物胁迫反应方面发挥着重要作用。Pyrabactin resistance 1-like(PYR/PYL)蛋白在ABA信号传导途径中起核心调控作用。然而,在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中并没有关于这个家族的细节。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的14个PYL基因,利用BLAST方法鉴定蒺藜苜蓿基因组中的PYL家族成员。结果表明,鉴定得到14个蒺藜苜蓿PYL基因家族成员,且所有成员均含有PYR-PYL-RCAR-like功能域。预测启动子中的顺式元件发现所有蒺藜苜蓿PYL基因家族成员均含有与胁迫以及激素相关的元件。基因本体论(GO)富集分析与KEGG通路分析显示其主要参与到脱落酸信号通路及对外界刺激的反应。基因表达模式分析显示,其在逆境胁迫下表现出特定的表达模式。本研究为进一步研究蒺藜苜蓿PYL基因奠定了基础。     

蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亚细胞定位及表达特征分析

Delta24-甾醇还原酶(Delta24-sterol reductase, DWF1)是油菜素内酯(Brassinosteroide, BR)合成途径中的关键酶，在植物生长发育中起着关键性的作用。为了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的功能，本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全长序列，该基因开放阅读框(ORF)1 704 bp,编码567个氨基酸，分子量65.911 kD,理论等电点为8.53。亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞质内。进化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红三叶(Trifolium pratense)及豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较为接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶中均有表达，在茎和叶中的表达水平较高。外源激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)能够明显提高MtDWF1表达，水杨酸(Salicylic acid, SA)能够显著降低MtDWF1表达水平。同时，经油菜素内酯诱导后，MtDWF1表达水平整体呈现增加趋势。本研究为进一步探索MtDWF...     

蒺藜苜蓿耐酸铝性状的全基因组关联分析

铝毒害是酸性土壤耕种的主要限制因素,每年造成大量作物减产。蒺藜苜蓿是紫花苜蓿的一年生近缘种,广泛分布于世界各地,是紫花苜蓿遗传改良的重要基因资源。本研究利用蒺藜苜蓿群体的耐酸铝性状差异,进行全基因组关联分析,筛选蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的遗传位点,共得到58个与蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的SNP标记。对其周围基因进行功能注释分析,发现这些SNP位点主要参与苜蓿的细胞壁、脂质代谢、环境胁迫响应过程、氧化还原反应过程以及小分子转运等过程。最后,通过基因组选择方法将发掘SNP标记应用到蒺藜苜蓿耐酸铝性状的预测,预测准确性达到0.80,这说明本研究发掘的SNP标记可以用于蒺藜苜蓿及其近缘物种紫花苜蓿耐酸铝性状的遗传改良。     

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老的转录组分析

为探究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）叶片衰老过程中相关基因的分子机制及代谢通路,本研究以其成熟叶片和衰老初期、中期、末期叶片为研究对象。通过转录组测序,比较4个发育阶段样品之间的转录组差异。结果表明,与成熟叶片相比,共筛选出2 990个差异表达基因（DEGs）,在所有衰老样本中表达水平均发生显著变化,其中有2 684条（89.77%）可进行基因功能注释;同时利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果证实了转录组测序的可靠性。进一步分析发现,DEGs涉及高等植物转录因子33个家族,包括ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC和bZIP。此外,还发现了837个与叶片衰老相关的基因。本研究发现了蒺藜苜蓿叶片衰老过程中大量差异表达的基因,为进一步分析蒺藜苜蓿叶片发育和衰老的调控机制提供参考。     

蒺藜苜蓿种子产量相关性状的遗传分析

通过对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)种子产量相关性状的田间调查,解析影响蒺藜苜蓿种子产量的主要构成因素。结果表明:搜集的38份蒺藜苜蓿种质资源在种子产量方面存在显著差异(P<0.05),选系J1.12单株平均种子产量明显高于其他材料;不同种质在分枝数、伸展长度、小花数、结荚数和百荚重等构成因素上存在显著差异(P<0.05);对蒺藜苜蓿种质种子产量与其构成因素间的相关性进行分析发现,伸展长度与种子产量相关性最大,相关系数为0.719,每荚种子数与种子产量相关性最小。通过系统聚类,参试蒺藜苜蓿种质可分为3个类群,并从中筛选6份种子产量特性差异大的蒺藜苜蓿种质作为杂交亲本,利用SSR、EST-SSR和SRAP引物检测亲本的多态性,发现6份亲本多态性差异明显;通过应用主基因+多基因遗传模型发现蒺藜苜蓿A17×A20组合的RILs群体种子产量性状的最佳遗传模型是2对加性-上位性主基因模型,该组合群体种子产量遗传以主基因为主,多基因遗传率较低,第二对主基因的加性效应值高于第一对主基因的加性效应值。     

豆科模式植物蒺藜苜蓿基因组研究进展

鉴于豆科植物的重要性和特殊性,近年来国际上发起将蒺藜苜蓿作为豆科基因组研究模式植物。由于具有基因组小、染色体数为2×8(2n=16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点,蒺藜苜蓿已代替百脉根(Lotus japonicusL.)做为豆科模式植物。国际蒺藜苜蓿基因组研究计划于2001年启动,基因组全序列测定即将完成。目前已经构建了细胞遗传学图谱、物理图谱和遗传图谱,获得EST序列189714条。蒺藜苜蓿基因组长度470Mbp(1C=0.47pg,2C=1.15pg),基因密度7Kbp/基因,平均GC含量33.3%。细胞遗传学分析表明,蒺藜苜蓿染色体基因组分成常染色质和异染色质两个明显的区域,常染色质区富集基因,异染色质区富集大量重复序列。蒺藜苜蓿80%的基因组以异染色质的形式聚集在着丝粒附近。蒺藜苜蓿与苜蓿和豌豆有非常高的共线性关系,与大豆在宏线性水平和微线性水平也有较高的共线性关系,是豆科作物比较基因组研究的好材料,有待在我国开展相关的研究。     

蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析

植物中MYB转录因子数量众多,功能多样,在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究MYB转录因子在蒺藜苜蓿中的功能,本研究采用PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtMYB16基因,该基因开放阅读框1074 bp,共编码357个氨基酸。进化树分析结果显示,MtMYB16蛋白与白花草木樨中MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示,MtMYB16蛋白具有自激活活性,自激活结构域位于C端。表达分析结果显示,MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达,在根中表达水平最高;IAA、MeJA能够降低MtMYB16表达水平;盐胁迫和干旱胁迫下,MtMYB16表达量在1.0 h时迅速增加,说明MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol, TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点。为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因。根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族。同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因。基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应。这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础。     

蒺藜苜蓿GPAT基因家族的全基因组鉴定、序列变异和表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate?acyltransferase,?GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol,?TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤,为多种脂质合成提供了底物,会直接参与到植物的生长发育和抗逆过程.蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)作为豆科模式植物具有基因组小、生长周期短、遗传转化效率高等特点.为了解GPAT基因在苜蓿抗逆尤其是在耐盐中的作用,本研究选择蒺藜苜蓿基因组为研究对象,采用Blastp和Hmm结构域搜索方法,共鉴定出24个mtGPAT基因.根据系统进化、基因结构和结构域差异将其分成3个亚家族.同时染色体定位分析发现,24个mtGPAT基因不均匀分布在7条苜蓿染色体上,每条染色体上分布有2～5个基因.基因表达谱分析表明:蒺藜苜蓿GPAT基因具有器官特异性,并且会参与盐胁迫反应.这些结果可为进一步深入研究蒺藜苜蓿GPAT家族基因的功能提供理论基础.     

蒺藜苜蓿cation/H+ exchanger基因家族鉴定及表达特征分析

CPA（cation proton antiporter）超家族通过转运质子和一价金属离子调节细胞内离子和pH稳定。阳离子质子转运体（cation/H⁺ exchanger,CHX）基因家族属于CPA2（cation proton antiporter 2）超家族,其N端有一个Na⁺/H⁺ exchanger结构域,对植物维持细胞离子平衡、花器官发育起着至关重要的作用。通过生物信息学手段,系统地分析了蒺藜苜蓿CHX家族基因,通过全基因组筛选共鉴定出47个MtCHXs;染色体定位分析表明蒺藜苜蓿CHX基因分布在8条不同的染色体上;同源性分析显示蒺藜苜蓿和拟南芥亲缘关系近,而与水稻亲缘关系远;进一步进化关系分析将47个MtCHXs基因分为5组,并且各组内成员在基因结构和基序上比较保守;顺式作用元件分析发现MtCHXs基因启动子包含大量光响应元件、激素响应元件以及干旱、低温、创伤响应元件;表达特性分析发现MtCHXs在生殖器官中高表达,并且响应干旱、低温等非生物胁迫。     

豆科模式植物——蒺藜苜蓿

由于蒺藜苜蓿具有高的遗传转化效率、生长期短、染色体组为2×8、基因组小、自花授粉、固氮等特点,使它成为豆科生物学和基因组学研究的模式植物。本研究描述了蒺藜苜蓿的形态特征,介绍了苜蓿属植物的系统关系及蒺藜苜蓿的分类学地位,概述了蒺藜苜蓿遗传图谱构建和基因组学研究的进展。     

紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化

NAP转录因子是植物体内特有的转录因子,在调控植物生长发育、衰老速度以及响应生物、非生物胁迫等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆紫花苜蓿NAP转录因子基因,将其命名为MsNAP(GenBank登录号:KM211498.1),MsNAP编码区长822bp,编码274个氨基酸。生物信息学分析显示:其与其他物种NAP蛋白具有较高的同源性,与蒺藜苜蓿同源性最高。荧光定量技术分析结果显示:MsNAP基因在花中表达量最高,衰老叶片中的表达水平远远高于未衰老叶片。利用DNA重组技术将MsNAP基因完整编码区连接至植物表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-MsNAP,通过农杆菌介导方法转化烟草,PCR和RT-PCR检测结果显示,成功获得了转MsNAP基因的转基因烟草,初步证明在转基因烟草中外源基因MsNAP能够转录表达,为研究MsNAP基因功能奠定了基础。