选择性5-羟色胺再摄取抑制剂对小胶质细胞不同活化途径的影响

目的 探讨SSRIs氟西汀和艾司西酞普兰对于小胶质细胞不同活化途径的影响.方法 新生2 dSD大鼠脑组织经洗涤、分离、消化、过筛网、离心等处理,获得原代小胶质细胞.将BV2细胞系组和原代细胞组进一步分亚组如下:空白对照组、M1型模型组、M2型模型组、氟西汀组和艾司西酞普兰组,干预24h后使用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹法测定相关炎症指标表达水平.结果 (1)M1型活化:RT-PCR示氟西汀可显著降低脂多糖联合干扰素-γ(LPS+INF-γ)诱导的BV2细胞白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor,TNF-a)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达(均P＜0.05).氟西汀和艾司西酞普兰均可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞IL-6(均P＜0.01)、TNF-a(P =0.018、0.029)和iNOS(均P=0.005)mRNA表达.免疫印迹法示氟西汀和艾司西酞普兰可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的BV2细胞Iba-1 (P ＜0.01、P=0.002)、CD86(均P＜0.01)蛋白表达.氟西汀和艾司西酞普兰均可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞CD86表达(均P＜0.01).ELISA示氟西汀可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的BV2细胞TNF-a(P=0.003)和IL-1 β(P=0.002)分泌.氟西汀和艾司西酞普兰可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞IL-1β分泌(均P＜0.01).原代小胶质细胞各组间TNF-a分泌差异无统计学意义(F=4.627,P=0.053),进一步组间比较示与模型组[(11.6±1.1)g/L]相比,艾司西酞普兰组[(20.2±1.9) g/L]TNF-a表达增高(P=0.012).(2)M2型活化:RT-PCR示氟西汀可显著提高IL-4诱导的原代小胶质细胞IL-10 mRNA表达(P=0.036).免疫印迹法示氟西汀可显著提高IL-4诱导的BV2细胞(P=0.016)和原代小胶质细胞(P＜0.01)CD206表达.ELISA示氟西汀可显著提高IL-4诱导的BV2细胞(P=0.044)和原代小胶质细胞(P＜0.01)IL-10分泌.结论 氟西汀和艾司西酞普兰可通过影响小胶质细胞活化状态而发挥免疫调节作用,这可能是SSRI类抗抑郁剂发挥抗抑郁作用机制之一.     

美满霉素对脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的探讨美满霉素(MC)对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法采用相应浓度的MC或LPS(100 ng/ml)对MC组及0.1、1、10、100μmol/L MC+LPS组、LPS组、空白对照组BV-2小胶质细胞进行预处理。ELISA法检测BV-2小胶质细胞TNF-α蛋白的表达,逆转录-PCR检测细胞TNF-αmRNA表达。结果与空白对照组比较,0.1、1μmol/L MC+LPS组及LPS组的TNF-α水平显著升高(均P0.01)。10、100μmol/L MC+LPS组TNF-α水平显著低于LPS组(均P0.01)。与空白对照组比较,LPS组及10μmol/L MC+LPS组TNF-αmRNA的表达水平显著增高(均P0.01)。10μmol/L MC+LPS组TNF-αmRNA表达水平显著低于LPS组(P0.01)。结论 MC预处理(≥10μmol/L)可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞TNF-α的表达。     

AM1241预处理对脂多糖所致小胶质细胞活化及损伤的影响

目的 探讨大麻素CB2受体激动剂AM1241预处理对联用脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)所致小胶质细胞活化和损伤的影响.方法 选择小鼠小胶质细胞进行实验,细胞分为对照组、AM1241组、LPS/IFN-γ组和AM1241+LPS/IFN-γ组.对照组细胞正常培养;AM1241组细胞经AM1241预处理2 h后正常培养;LPS/IFN-γ组细胞用含1 μg/mL LPS和50 U/mL,IFN-γ的培养基培养24 h;AM1241+LPS/IFN-γ组细胞经AM1241预处理2 h后,更换正常培养基培养2 h,最后用含1 μg/mL LPS和50 U/mL IFN-γ的培养基培养24 h.采用MTT法检测细胞代谢率,NO检测试剂盒检测细胞培养液中NO释放量,倒置相差显微镜观察细胞形态.结果 AM1241+LPS/IFN-γ组细胞代谢率为92.55%±8.37%,明显高于LPS/IFN-γ组(75.04%±3.01%),差异有统计学意义(P<0.05).AM1241+LPS/IFN-γ组细胞培养基中NO浓度为(43.44±5.52) μmol/L,明显低于LPS/IFN-γ组[(90.87±4.28)μmol/L],差异有统计学意义(P<0.05).LPS/IFN-γ组大量细胞结构被破坏,胞体增大,伪足增粗、变短或消失;AM1241+LPS/IFN-γ组少量细胞结构被破坏,胞体稍增大,伪足较明显.结论 大麻素CB2受体激动剂AM1241预处理可减轻联用LPS和IFN-γ所致的小胶质细胞活化和损伤.

Abstract：

Objective To investigate the effect of preconditioning with cannabinoid CB2 receptor agonist AM1241 on microglial activation and injury induced by lipopolysaccharide ( LPS) and interferon-γ (IFN-γ). Methods The microglial cells were chosen and assigned to control group,AM1241 treatment group, LPS/IFN-γ inducement group and AM1241+LPS/IFN-γ treatment group. Cells of control group were cultured in normal medium;cells of AM1241 treatment group were preconditioned with AM 1241 for 2 h, and then the medium was changed with normal medium;cells of LPS/IFN-γ inducement group were exposed to the medium containing 1 μg/mL LPS plus 50 U/mL IFN-γ for 24 h;cells of AM1241+LPS/IFN-γ treatment group were preconditioned with AM1241, then the medium were changed with normal medium for 2 h, and at last, cells of this group were exposed to 1 μg/mL LPS plus 50 U/mL IFN-γ for 24 h. Microglial metabolism was assessed by MTT assay;NO release was measured by Reagent Kit;microglial shapes were observed through microscope. Results CB2 receptor agonist preconditioning can up-regulate the microglial CB2 receptor expression markedly;cell metabolism of AM1241+LPS/IFN-γ treatment group (92.55 ±8.37%) was obviously higher than that of LPS/IFN-γ inducement group (75.04±3.01%, P<0.05);AM1241+LPS/IFN-γ treatment group (43.44±5.52 μmol/L) released significantly less NO than LPS/IFN-γ inducement group (90.87±4.28 (μmol/L, P<0.05). Cells of the LPS/IFN-γ inducement group were destroyed seriously with enlarged soma and thickened and shortened pseudopodium;cells of the AM1241+LPS/IFN-γ treatment group were destroyed slightly with slightly enlarged soma and thickened and shortened pseudopodium. Conclusion Preconditioning with cannabinoid CB2 receptor agonist AM1241 reduces microglial activation and injury induced by LPS plus IFN-γ.     

姜黄素抑制BV2细胞RAGE/NF-κB通路发挥对多巴胺能神经细胞的保护作用

目的探讨小胶质细胞在多巴胺能神经细胞损伤中所起的作用以及姜黄素通过抑制小胶质细胞的炎症反应发挥保护作用。方法选用鼠小胶质细胞系BV2细胞株和神经元SH-SY5Y细胞作为研究对象,利用鱼藤酮(Rotenone,RO)建立细胞损伤模型,10 nmol/L RO处理BV2细胞6 h后再经不同浓度(1、5、10μmol/L)姜黄素(Curcumin,Cur)处理4 h,收集BV2细胞上清液作为条件培养基处理SH-SY5Y细胞,并设置空白对照组。采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测两种细胞活力,Western blot检测细胞BV2细胞内RAGE/NF-κB表达,ELISA法测定BV2细胞培养上清液细胞因子含量。结果 1~10μmol/L的Cur并未影响BV2细胞的增殖活力;与空白对照组相比,RO组RAGE/NF-κB的蛋白表达明显升高(P0.01),与RO组相比,Cur处理组RAGE/NF-κB的蛋白表达量显著减少(P0.05);与空白对照组相比,RO组炎症因子的分泌量明显升高(P0.01),与RO组相比,Cur处理组随着浓度的升高炎症因子的分泌量逐渐减少(P0.05);受条件培养基处理的SH-SY5Y细胞,与对照组相比,RO组细胞活力明显减弱(P0.01),但Cur处理组的细胞活力较RO组升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Cur通过抑制小胶质细胞反应,从而保护多巴胺能神经细胞。     

实验性自身免疫性重症肌无力大鼠T淋巴细胞IFN-γ-iNOS-NO通路的研究

目的 探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠T淋巴细胞干扰素-γ(IFN-γ)-诱导型一氧化氮合酶(iNOS)-一氧化氮(NO)通路的表达水平.方法 将大鼠随机分为EAMG组、正常对照组、完全弗氏佐剂(CFA)对照组.EAMG组大鼠分别于足垫、腹部及背部皮下多点注射丁氏双鳍电鳐的电器官乙酰胆碱受体(AChR)蛋白乳剂共1 ml,第4周再次注射上述乳剂;CFA对照组在相应时间、用相同的方法注射等量CFA;初次注射7周后,分离各组大鼠脾脏T淋巴细胞,体外培养48 h后取上清液分别应用酶联免疫吸附试验和Griess试剂法,检测IFN-γ和NO水平.结果 IFN-γ含量EAMG组为(81.68±10.23)pg/ml,正常对照组为(29.20±5.41)pg/ml,CFA对照组为(31.54±6.12)pg/ml;NO含量EAMG组为(23.68±7.13)μmol/L,正常对照组为(9.05±2.11)μmol/L,CFA对照组为(10.21±2.67)μmol/L;EAMG组IFN-γ和NO水平显著高于正常对照组和CFA对照组(均P＜0.01);正常对照组和CFA对照组间差异无统计学意义.结论 EAMG大鼠T淋巴细胞IFN-γ和NO分泌明显提高;T淋巴细胞IFN-γ-iNOS-NO通路异常可能与MG发病有关.     

MBP对PBMC产生IFN-γ和NO的影响

目的探讨T细胞非特异性活化在CNS脱髓鞘性疾病中的作用。方法分离实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)易感性BALB/c小鼠外周血单个核细胞(PBMC),采用体外细胞培养方法在体外与碱性髓鞘蛋白(MBP)共培养,测定培养上清液中IFN-γ、NO水平。结果经MBP刺激的PBMC产生IFN-γ[(43.83±6.06)pg/mL]和NO[(180.76±20.75)μmol/L]明显增加,与对照组产生的IFN-γ[(28.52±2.18)pg/mL]和NO[(95.61±13.09)μmol/L]相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论在CNS脱髓鞘性疾病发病过程中,活化的T细胞、单核细胞等分泌致炎细胞因子和其他有害物质增多。     

连翘苷对LPS刺激的BV2小胶质细胞炎性反应的抑制作用

目的探索连翘苷对脂多糖(LPS)刺激的小胶质细胞BV-2的细胞炎症因子释放的抑制作用和机制。方法采用LPS(0.1 g/ml)刺激小胶质细胞建立神经退行性疾病(帕金森病)炎症模型,MTT法检测连翘苷对BV2的细胞毒性;硝酸还原酶法检测连翘苷对LPS刺激BV2细胞一氧化氮(NO)表达量的影响;一氧化氮合酶分型法检测连翘苷对LPS刺激BV2细胞一氧化氮合酶(i NOS)活性的影响;Western-blot法检测连翘苷对LPS刺激BV-2细胞TLR4蛋白表达影响。结果 50~200μg/ml连翘苷能抑制LPS诱导BV2细胞的炎症反应。结论连翘苷能够抑制小胶质细胞活化产生的炎症反应,其机制可能是通过抑制TLR4信号通路而发挥效用。     

腺苷A_(2A)受体激动剂CGS21680抑制激活的原代小胶质细胞肿瘤坏死因子-α的表达

目的探讨腺苷A_(2A)受体激动剂CGS21680对激活的原代小胶质细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法采用新生小鼠大脑皮质小胶质细胞原代培养技术,将培养的原代小胶质细胞随机分为3组。(1)对照组:空白对照;(2)脂多糖(LPS)组:诱导小胶质细胞激活,制作小胶质细胞炎症细胞模型;(3) CGS21680处理组:小胶质细胞炎症细胞模型基础上叠加CGS21680处理,CGS21680处理组按CGS21680不同浓度分为0.01、0.1、1和10μmol·L~(-1)4个亚组。采用ELISA法检测各组TNF-α含量。结果 LPS孵育24 h后,与LPS组比较,CGS21680 0.1μmol·L~(-1)处理组、CGS21680 1μmol·L~(-1)处理组和CGS21680 10μmol·L~(-1)处理组的TNF-α表达水平显著降低(均P0.001)。与LPS组比较,CGS21680 10μmol·L~(-1)处理组的12、24、48和72 h时间点TNF-α表达水平均显著下降(抑制作用),呈显著的干预作用和时间-效应关系(均P0.05)。结论腺苷A_(2A)受体激动剂CGS21680可明显抑制激活的小胶质细胞的炎症反应。     

神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响

目的探讨神经肽Y(NPY)对原代小神经胶质细胞生物活性及生成IL-1β的影响。方法培养的原代大鼠皮层小胶质细胞,将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组,每组3个样本,培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后,显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。Elisa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量,RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βm RNA表达水平。结果孵育各组小胶质细胞6h后,LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及细胞中IL-1βm RNA表达水平分别为(961.00±83.50)pg/m L和5.59±0.87,显著高于Control组的96.33±24.58 pg/m L和1.05±0.12(P0.05),小胶质细胞处于活化状态;LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(411.33±55.00)pg/m L和1.93±0.45,与LPS组相比显著降低(P0.05),小胶质细胞活化水平降低;IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(886.00±97.53)pg/m L和4.51±0.71,与LPS+NPY组相比显著增高(P0.05);LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无统计学意义。NPY组与对照组无统计学意义。结论 NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞的生物活性,抑制其生成IL-1β。     

多西环素对LPS诱导的BV-2细胞MHCII表达的抑制效应

目的研究多西环素对LPS诱导的BV-2细胞MHCII表达的影响及其分子机制。方法 BV-2细胞作为小胶质细胞的替代细胞。(1)按常规方法培养BV-2细胞;(2)分组及处理:①对照组:不加任何特殊处理;②脂多糖组:脂多糖(100ng/ml)与BV-2细胞共孵育24h;③多西环素预处理组(多西环素+LPS):BV-2细胞在6孔板分别与多西环素(3个浓度梯度:50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)预孵育30min,然后,细胞再用脂多糖(100ng/ml)处理24h;④多西环素对照组:用细胞免疫荧光共聚焦显微镜观察。(3)Westen Blot检测MHCII蛋白的表达。结果 (1)细胞免疫荧光显示,分别用3种浓度(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)多西环素预处理后,BV-2细胞MHCII的表达减少,并有量-效关系;(2)Westen Blot显示,多西环素预处理后,BV-2细胞的MHCII蛋白表达减少,3种浓度梯度显示有量-效关系(P<0.01)。结论研究初步证实多西环素预处理能够抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞MHCII的表达。     

氟西汀对大鼠星形胶质细胞分泌的胶质源性神经营养因子的影响

目的 探讨氟西汀对大鼠星形胶质细胞分泌的胶质源性神经营养因子(GDNF)的影响.方法 以氟西汀干预体外培养的大鼠海马星形胶质细胞,通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度氟西汀对细胞活力的影响;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养液GDNF浓度及Real-time PCR法检测GDNFmRNA的表达.结果 (1)氟西汀浓度超过35 μmol/L浓度时,可降低细胞活性,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);(2)10 μmol/L氟西汀干预星形胶质细胞不同时间后,48 h组细胞培养液GDNF浓度[(68±13)fg/L]高于0 h组[(32±11)fg/L]、6 h组[(34±12)fg/L]、12 h组[(41±17)fg/L]、24 h组[(45±13)fg/L],差异均有统计学意义(P均<0.01);(3)不同浓度氟西汀作用星形胶质细胞48 h后,10 μmol/L浓度组的细胞培养液GDNF浓度[(64±17)fg/L]高于0 μmol/L[(39±15)fg/L]和1 μmoVL浓度组[(39±18)fg/L],差异均有统计学意义(P均<0.05);(4)氟西汀作用星形胶质细胞48 h后,撤离氟西汀24 h后星形胶质细胞仍明显分泌GDNF,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);(5)不同浓度氟西汀作用星形胶质细胞24 h后,10 μmol/L和20 μmol/L浓度组细胞GDNFmRNA表达量[分别为(0.008 1±0.001 1)和(0.006 3±0.000 3)]高于0 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L浓度组[分别为(0.003 1±0.000 7)、(0.003 9±0.000 3)和(0.004 1±0.000 2)],差异均有统计学意义(P均<0.01).结论 氟西汀可能通过促进星形胶质细胞GDNF的分泌来发挥其神经保护作用.     

沉默信息调节因子1抑制核因子κB通路调控癫痫大鼠小胶质细胞活化的机制研究

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)在癫痫中对小胶质细胞及炎症因子的影响及作用机制.方法建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型,免疫组化观察各组(对照组和癫痫组)大鼠脑组织内小胶质细胞活化;采用脂多糖(LPS)建立小胶质细胞活化模型,构建pcDNA-SIRT1和si-SIRT1载体,转染至大鼠小胶质细胞中.定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)测定大鼠海马组织及小胶质细胞中SIRT1表达,Western blot检测小胶质细胞的活化标志物Iba1和核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白(p65和IκBα)的蛋白表达水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测促炎因子[白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)]的表达水平.结果与Control组比较,癫痫大鼠海马组织中SIRT1 mRNA表达量显著降低(P<0.05),Iba1蛋白表达量显著增加(P<0.05),且对照组CA1、CA2区Iba1阳性细胞数分别为(180±21)、(190±18)/mm2,癫痫组CA1、CA2区Iba1阳性细胞数分别为(412±35)、(470±37)/mm2,两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05).同样,与Mock组比较,LPS活化小胶质细胞中SIRT1表达水平显著降低,Iba1蛋白表达水平显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05).转染pcDNA-SIRT1及si-SIRT1至LPS活化的小胶质细胞中,LPS+pcDNA-SIRT1组IL-1β[(50.0±3.3)ng/L]、IL-6[(55.0±3.2)ng/L]和TNF-α[(56.1±3.0)ng/L]表达水平显著低于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05);LPS+si-SIRT1组中IL-1β[(98.2±4.3)ng/L]、IL-6[(108.1±4.5)ng/L]和TNF-α[(124.5±4.1)ng/L]表达水平显著高于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05);同时LPS+pcDNA-SIRT1组NF-κB p65的表达水平显著低于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05),IκBα的表达水平显著高于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05);而LPS+si-SIRT1组NF-κB p65的蛋白表达水平显著高于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05),IκBα的表达水平显著低于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05).加入NF-κB通路激活剂Aconine后,与LPS+pcDNA-SIRT1组比较,LPS+pcDNA-SIRT1+Aconine组大鼠中Iba1表达水平显著升高(P<0.05);LPS+pcDNA-SIRT1+Aconine组大鼠中IL-1β[(72.2±4.3)ng/L]、IL-6[(80.1±4.0)ng/L]和TNF-α[(87.2±4.5)ng/L]表达水平显著高于LPS+pcDNA-SIRT1组的[(50.1±2.3)]ng/L、[(55.0±3.4)]ng/L和[(56.3±4.9)ng/L](均P<0.05).结论SIRT1可能通过抑制NF-κB通路活性来抑制癫痫大鼠小胶质细胞的作用.     

CGS21680对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症细胞模型白细胞介素-1β表达的影响

目的探讨CGS21680对脂多糖(LPS)诱导的小鼠大脑皮质小胶质细胞炎症细胞模型白细胞介素-1β(IL-1β)表达的影响。方法采用新生小鼠大脑皮质小胶质细胞原代培养技术,将培养的小胶质细胞随机分组,设为对照组(加入单纯的DMEM/F12完全培养基)、LPS组(制作小胶质细胞炎症细胞模型)、CGS21680组(小胶质细胞炎症细胞模型基础上叠加CGS21680处理),CGS21680组再按CGS21680不同浓度分为0.1、1和10μmol·L~(-1)CGS21680亚组。ELISA检测各组24 h后IL-1β含量。结果 CGS21680组较LPS组小胶质细胞IL-1β表达量显著下降。结论 CGS21680可明显抑制LPS诱导的小鼠大脑皮质小胶质细胞的炎症反应。     

二氢杨梅素抑制脂多糖诱导后BV2细胞HMGB1的核质转位和释放

目的 探索二氢杨梅素(Ampelopsin,AMP)对脂多糖(LPS)刺激的小胶质细胞BV2高迁移率族蛋白B1(HMGB1)核质转位和释放的影响。方法 不同浓度的二氢杨梅素(10μmol/L,30μmol/L,50μmol/L)联合LPS处理BV2细胞,用Elisa法检测HMGB1的分泌水平;细胞核质分离方法检测HMGB1核/质转位;免疫共沉淀检测HMGB1磷酸化的表达情况;免疫印迹检测JAK2、STAT3磷酸化水平。结果 不同浓度的二氢杨梅素显著抑制了LPS引起的BV2细胞HMGB1释放,减少了LPS诱导的HMGB1由细胞核到细胞质的转位。免疫共沉淀和免疫印迹结果表明:二氢杨梅素可减少HMGB1磷酸化水平,抑制LPS诱导的JAK2-STAT3信号通路激活。结论 二氢杨梅素可以抑制LPS介导的BV2细胞HMGB1的转位和释放,其主要机制可能是通过降低HMGB1的磷酸化以及抑制JAK2-STAT3信号途径。     

Purmorphamine对BV2细胞帕金森病相关基因Nurr1表达的影响

目的探讨Purmorphamine(PM)激活小胶质细胞瘤BV2细胞中Sonic hedgehog(SHH)信号通路对帕金森病(PD)相关基因Nurr1表达的影响。方法体外培养BV2小胶质细胞并分为对照组、脂多糖(LPS)处理组、PM+LPS处理组以及PM处理组,运用荧光定量PCR(Q-PCR)检测经LPS处理后BV2细胞中SHH信号通路Smoothened(Smo)、Gli1及Nurr1基因mRNA表达情况;PM激活SHH信号通路后,Q-PCR检测Nurr1mRNA含量以及炎性反应因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达情况。结果(1)与对照组相比,LPS处理后4h和24h时Smo和Gli1mRNA表达均升高(P0.01,P0.05);(2)与对照组相比,PM处理组细胞Smo和Gli1mRNA表达升高(P0.01),LPS组Nurr1、IL-1β、TNF-αmRNA表达亦均升高(均P0.01);而PM+LPS组Nurr1、IL-1β、TNF-αmRNA表达均较LPS处理组下降(均P0.01)。结论PM激活SHH信号通路能够抑制BV2细胞中Nurr1的表达,并能发挥抑制炎性反应作用。     

WAR-5、Fasudil治疗EAE的疗效比较及作用机制研究

目的比较WAR-5与盐酸法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果,并探究其作用机制。方法采用小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)免疫雌性C57BL/6小鼠建立慢性EAE模型,并随机分为EAE对照组、WAR-5治疗组和Fasudil治疗组。于免疫后第3天开始,分别腹腔注射WAR-5、Fasudil及生理盐水,比较各组小鼠体质量变化和临床评分。于免疫后第28天处死各组动物,制作脊髓冰冻切片进行CD4+T细胞、CD68+巨噬细胞及核转录因子-κB(p-NF-κB/p65)染色,观察其在脊髓中的表达。提取脑组织的蛋白用Western blot法检测Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)Ⅱ和p-NF-κB/p65蛋白表达,并采用Griess法检测脾细胞培养上清液的一氧化氮(NO)释放水平。结果与EAE对照组(108.70±20.26、399.00±25.94)比较,WAR-5治疗组(13.67±4.041、52.67±13.43)及Fasudil治疗组(15.33±5.033、31.00±13.45)脊髓内CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞数目均减少(均P0.01),WAR-5与Fasudil两治疗组相比,差异无统计学意义。与EAE对照组(1.9500±0.3976、0.5885±0.05982)比较,WAR-5组(0.6137±0.1778、0.0096±0.0015)及Fasudil组(1.1960±0.2225、0.3574±0.1496)脑内ROCKⅡ、p-NF-κB/p65表达均降低,WAR-5治疗组脑内ROCKⅡ、p-NF-κB/p65表达亦均低于Fasudil治疗组(均P0.05)。WAR-5和Fasudil治疗组上清液NO含量分别为(16.40±0.5247)μmol/L、(17.69±0.2833)μmol/L,均低于EAE对照组〔(20.07±0.6116)μmol/L;均P0.001〕,且WAR-5治疗组低于Fasudil治疗组(P0.01)。与Fasudil治疗组比较,800μg及1600μg药物注射后,WAR-5治疗组小鼠的存活状态明显较好;800μg药物注射后,WAR-5治疗组小鼠的脚趾无明显血管扩张反应。结论 WAR-5对EAE的治疗效果与Fasudil相近,且其治疗安全性较好,扩张血管作用较小,其作用机制可能与WAR-5抑制小鼠ROCKⅡ的表达及抑制炎性反应相关。     

EGCG对H2O2诱导BV2细胞氧化损伤保护作用机制的研究

目的探讨EGCG对H2O2诱导BV2细胞氧化损伤的保护作用机制。方法以200μmol/L H2O2制备BV2细胞氧化应激损伤模型,用CCK-8法检测不同浓度EGCG(0、1、5、10、20、40、80μmol/L)的保护作用,Ho-echst33258染色法检测细胞的凋亡,Western bloting法检测caspase-9蛋白的表达。结果 10及20μmol/L的EGCG组保护效果较明显;EGCG保护组的凋亡细胞显著少于无保护组;20μmol/L EGCG保护组的caspase-9蛋白表达较无保护组明显下调(P=0.03<0.05)。结论 10及20μmol/L浓度的EGCG对H2O2诱导的BV2细胞损伤模型有保护作用,其机制可能是通过减少caspase-9蛋白的表达,进而部分阻断caspase-9所介导的caspases级联反应,减少BV2细胞的凋亡。     

PPARγ激动剂筛选细胞模型的构建及验证姜黄素为PPARγ天然激动剂的研究

目的构建过氧化小体增殖剂激活型受体γ(peroxisome prolifterator-activated receptor,PPARγ)激动剂筛选细胞模型,验证姜黄素是不是PPARγ的天然激动剂,结合可能的PPARγ路径机制分析姜黄素在脑血管病治疗中的应用前景。方法利用电转染技术在U937(自身不表达PPARγ)细胞中共转染PPARγ表达质粒加报告质粒(PPARγ激动剂筛选细胞模型)及单独转染报告质粒;在不同组别的细胞中分别加入吡格列酮(PPARγ已知激动剂)和不同浓度的姜黄素(10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L)后测定报告质粒中虫荧光素酶表达活性。结果共转染细胞组加入吡格列酮20μmol/L后荧光强度较对照组荧光强度增加3.8倍,差异显著(P<0.01),单独转染PPARγ报告质粒细胞组,加入吡格列酮未导致荧光增强;共转染细胞组加入不同浓度的姜黄素(10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L)后,3种不同浓度的姜黄素较对照组荧光增加的倍数分别为1.52、2.38和2.97,各组别浓度的姜黄素和对照组比较均差异显著(P<0.01);其中低浓度姜黄素组明显低于中高浓度姜黄素组(P<...     

小檗碱对阿尔茨海默病大鼠模型小胶质细胞活化的影响

目的 研究小檗碱对阿尔茨海默病(AD)大鼠模型小胶质细胞活化的影响. 方法 18只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组和小檗碱组,每组各6只.后两组通过大鼠双侧海马立体定向注射凝聚态AB40(5 μg/L)建立AD大鼠模型,小檗碱组造模后灌胃给予小檗碱[50mg/(kg·d)]14 d.采用免疫组织化学法、实时荧光定量PCR法和Western blot法研究小檗碱对小胶质细胞活化标志物CD11b和炎症负调节因子过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)表达的影响.结果模型组和小檗碱组大鼠海马CD11b阳性细胞数(74.0±13.4、121.5±19.9)、CD11b mRNA的相对拷贝数(4.08±2.43、5.52±1.83)较正常组(23.2±6.2、2.54±0.98)明显增加,PPARTγ阳性细胞数(42.5±5.6、31.7±8.7)、PPAR7mRNA的相对拷贝数(16.3±13.5、10.8±7.5)、PPARγ蛋白相对表达量(0.18±0.08、0.09±0.05)较正常组(93.2±11.3、40.6±17.1、0.31±0.111明显减少,比较差异有统计学意义;小檗碱组大鼠较模型组进一步增加海马CD11b阳性细胞数、CD11b mRNA的相对拷贝数和减少PPART阳性细胞数、PPARγ mRNA的相对拷贝数、PPARy蛋白相对表达量. 结论 小檗碱通过抑制PPARy的表达促进AD大鼠模型小胶质细胞的活化.