纳豆激酶基因在家蚕生物反应器中的表达

纳豆由枯草杆菌(Bacillussubtilis)或纳豆菌(Bacil-lusnatto)发酵大豆而成。1987年,日本学者须见洋行等首次从传统食品纳豆中发现了一种具有溶栓活性的酶制剂,并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。纳豆激酶具有易于提取.溶栓效果好.无毒副作用,体内半衰期长,成本低,可降压、杀菌和抗病毒等优点,因而可能成为新一代的抗栓药物。杆状病毒是一类闭合双链DNA病毒,昆虫杆状病毒表达系统是80年代建立起来的真核表达系统.其表达效率高.具有包括糖基化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统.其表达产物多具有可进行翻译后修饰.具有与天然产品相似的生物活性     

猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT—PCR技术克隆了猪生长激素(pGH)cDNA，该基因编码蛋白的信号肽序列与已有报道的pGH基因存在2个氨基酸残基的差异，而成熟肽却无差异。将pGHcDNA定向插入真核表达载体VRl020，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，对转染后的COS7细胞进行RT—PCR、ELlSA和免疫荧光分析，分另1在转录和翻译水平证实了目的基因在COS7细胞中得到正确转染表达。     

表达小黄鱼生长激素的转基因家蚕品系构建

构建转小黄鱼生长激素基因的家蚕新品系,外源表达鱼生长激素。通过检索小黄鱼转录组序列,获得小黄鱼生长激素和转铁蛋白的编码序列,设计并合成以接头序列连接,N端为生长激素、C端为转铁蛋白的融合蛋白编码框。利用piggyBac转座子介导的转基因方法,将融合基因转入家蚕基因组中,转育得到可表达小黄鱼生长激素且人工饲料摄食性较好的转基因家蚕品系皓月-Fc,蛹体中小黄鱼生长激素表达量最高约为0.27 ng/mg,蚁蚕24 h疏毛率约为85%。构建的转基因家蚕品系为下一步小黄鱼功能性饲料添加剂的研发打下基础。     

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR将增得到pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67-A中，构建重组质粒pGP67pGH，并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV-OCC)基因组DNA共转染Sf9细胞，构建出重组病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OC^-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果表明，细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为22kDa的猪生长激素特异性反应带，且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些，薄层扫描仪扫描估测可知，重组pGH分别占细胞可溶蛋白的8．98％和培养液上清总蛋白的3.61%。将表达96h的培养液上清浓缩液进行N－糖基化分析，结果显示重组pGH无N－糖基化加工修饰。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

含第一内含子猪生长激素cDNA基因在COS7细胞中的表达

以CMV真核生物启动子构建了含第一内含子猪生长激素（pGH）cDNA基因（pGHcDNA-in）的表达载体，经DEAE-葡聚糖介导在COS7细胞进行了瞬时表达，通过PP95生物学测定法测定，证明含第一内含子pGHcDNA基因能够在真核细胞中进行分泌性表达，表达出的pGH具有生物学活性。这说明通过该基因转录出的前体mRNA能够在COS7细胞中进行正确剪接，从而翻译出具有生物活性的pGH。加入第一内含子在一定程度上可提高pGHcDNA基因的表达效率。     

猪带绦虫45W-4B基因在家蚕细胞中的表达

猪带绦虫45W基因已被认为是预防猪囊虫病的基因工程疫苗候选基因之一。其中4B基因是45W基因家族中高度保守的一个成员（以下称45W-4B）。本试验将重组于pGEM-3Z载体上的4B基因转载到pVL1393转移载体中，通过鉴定获得重组质粒pVL1393-4B，然后将重组质粒与BmNPV病毒共转染，筛选出重组BmNPV-4B重组病毒，用该重组病毒感染Bm细胞，收集细胞上清，SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白，并经Western blot检测表明该蛋白能识别囊虫病人（猪）阳性血清，45W-4B蛋白的成功表达对进一步研究45W蛋白的结构和功能以及开发高效猪囊虫基因工程疫苗打下了基础。     

转基因家蚕生物反应器研究进展

综述了近年来国内外转基因家蚕生物反应器研究进展,分析探讨了现阶段利用转基因家蚕生物反应器表达外源基因研究中存在的问题及发展方向。     

生长激素与生长激素受体基因的表达

在动物生长轴中，GH是调控动物生长发育的核心激素，它具有促生长作用。但GH发挥生理作用的第一步是与靶细胞膜表面的GH受体(GHR)结合，由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列生理效应。在生理激素浓度下，GH 与GHR 以1／2相结合。在超生理激素浓度下，激素饱和了所有的受体分子形成1／1的复合物，阻止了受体二聚化和信息传递。当GH水平提高而GHR基因表达没改善时，不仅GH的作用不能完全发挥，而且可能因为GH过剩而产生负反馈调节，影响其他生理功能。这可能是某些促生长激素轴功能的添加剂在使用一段时间后效果减弱的原因之一。因此，在直接或间接提高GH水平的同时，应该提高GHR基因表达水平，才能最大限度发挥GH的作用。促进GHR基因表达有促进动物生长发育和发展的趋势，可使畜禽生产性能在较高水平的情况下再上新台阶。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

家蚕生物反应器表达hGM-CSF产业化若干问题的研究

报道了家蚕杆状病毒表达hGM CSF产业化过程中几个问题的研究结果。鲜茧在 4～ 7℃保存可显著抑制蚕蛹的发育 ,但随冷藏时间的延长 ,死笼率明显上升 ,接种成功率显著下降 ;接种蚕蛹血淋巴中hGM CSF的活性与鲜茧保存时间有明显的负相关关系 ;生产工艺不同 ,蚕蛹冻干粉中hGM CSF的活性有明显差异 ;60 Co辐照可使冻干蚕蛹粉中微生物的数量减少 ,但同时蚕蛹中hGM CSF的活性也随辐照剂量的增加而有所降低 ,hGM CSF蚕蛹粉经 30 0 0Gyγ射线辐照后 ,口服仍使小鼠白细胞明显上升。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

猪白细胞介素-6基因的非融合原核表达研究

用DNA重组技术，将已克隆的猪IL-6基因阅读框片段插入非融合原核表达质粒pBV220中的适当位置，获得重组质粒pBVpIL-6，转化大肠杆菌DH5α后，42℃诱导阳性表达菌。经SDS-PAGE检测发现目的蛋白获得了高效表达，表达量约占总蛋白的20％。表达的蛋白以包涵体形式存在，包涵体经过变性溶解和复性后用酶联免疫吸附试验（ELISA）做定性定量检测。ELISA结果证实了所表达的蛋白为猪IL-6，复性后具有一定活性．并测出了复性后活性蛋白的浓度。     

利用家蚕生物反应器生产基因工程疫苗的研究

本文就家蚕核型多角体病毒BmNPV的生物学特性及其作为表达载体的优点、家蚕生物反应器的原理、生产程序、特点、优化表达策略以及在基因工程疫苗生产中的应用作了较为详细的阐述。     

猪生长激素基因及其多态性的研究概况

就猪生长激素（PGH）基因的定位，结构，多态性研究概况作一简要地介绍，并对以后的研究方向作了展望。     

猪白细胞介素2／6嵌合基因的融合表达及活性

采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgG Fc基因在HeLa细胞中的融合表达

根据GenBank中发表的猪的IgG Fc段基因及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计并合成引物.以猪肝组织总RNA为模板扩增出猪IgG Fc基因,以舍全长IBV M41 S基因的质粒为模板扩增出IBV S1基因,分别克隆至T裁体.DNA测序表明,所获得的IBV S1基因大小为1.5 kb,lgG Fc大小为1 kb,序列正确.将IBVS1与IgG Fc基因串连,插入舍有人组织型纤维蛋白溶酶原激活物分泌信号肽序列(tPA)的真核表达载体pcDNA3.1-tPA上,在HeLa细胞上进行瞬时融合表迭.经免疫光和斑点杂交检测,表达产物同时具有IBV S1蛋白和IgG Fe活性.     

生长激素基因多态性与猪部分生产性能的关系

采用PCR-RFLP对南昌白猪(117头)和大约克夏猪(361头)的GH1基因的-119bp～+486bp进行了扩增,并用HhaⅠ酶切,产生4个等位基因:C1(605bp)、C2(498bp+107bp)、C3(449bp+156bp)和C4(449bp+107bp+49bp)。分析了不同基因型对平均初生重、2月龄体重、6月龄体重、料重比、校正背膘厚、平均背膘厚和瘦肉率等生产性能的影响。结果表明,在南昌白猪中,C2C2基因型猪的2月龄体重比C1C1基因型猪的大,差异显著(P<0.05)。在大约克夏猪中,C3C3基因型猪的初生重最小,与C2C4基因型猪的相比,差异极显著(P<0.01);C2C4基因型猪的6月龄体重最大,与C2C3和C3C3基因型猪的相比,差异显著(P<0.05)。