酶联免疫法检测克伦特罗残留量的质量控制

对酶联免疫法检测克伦特罗残留量的质量控制方法进行了探讨.应用酶联免疫法检测克伦特罗残留量可从克伦特罗试剂盒的检测下限、校正曲线的线性检验、精密度验证、以及添加克伦特罗标准品做回收率试验等方面来进行质量控制.结果表明,本方法的样品检测下限(定性检出)为0.03ng/mL,定量检测下限为0.1ng/mL;克伦特罗标准校正曲线Y=-0.1884X 0.4159在0.1～8.1ng/mL范围内具有良好的线性相关关系,相关系数为-0.9913;克伦特罗标准液的浓度分别为0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL时,变异系数分别为3.7%、5.3%、9.7%、9.2%、8.7%,在3.7%～9.7%的范围内;当克伦特罗标准品添加水平分别为0.5、1.0ng/mL时,平均回收率分别为84%、90%,在80%～100%的范围内.上述指标均符合残留分析质量控制的要求.     

电化学酶免疫传感器在食品安全检测中的研究进展

电化学酶免疫传感器是一种标记型的免疫传感器,它结合了酶的放大作用和免疫传感器的灵敏度及特异性,是近几年来研究最多、发展最快,应用最广的一种免疫传感器.本文综述了电化学酶免疫传感器的特点及其在食品安全领域(包括食源性致病菌、生物毒素、药物残留等)的研究应用进展,并且对酶免疫传感器的发展前景进行了展望.     

出口肉及制品中盐酸克伦特罗的ELISA检测方法的建立

介绍了酶联免疫吸附法测定出口肉及制品中的盐酸克伦特罗的方法。利用盐酸克伦特罗试剂盒对出口肉及制品中残留的盐酸克伦特罗用酶标仪进行测定分析,结果显示,盐酸克伦特罗的交叉反应为100%,猪肉罐头和牛肉中的检测限(LOD)为0.026(μg/kg)和0.028(μg/kg),样品的平均回收率在83.6%～91.3%之间,相对标准偏差为3.5%～5.6%,经HPLC确证假阳性率≤2.0%。表明酶联免疫分析定量法可快速、准确实现对食品中盐酸克伦特罗残留量的快速筛选。     

旋转生物传感器高灵敏检测盐酸克伦特罗方法研究

盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride, CL),又名双氯醇胺、氨哮素、克喘素,为白色结晶状粉末, 无味略苦,是一种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂。盐酸克伦特罗又称"瘦肉精",被非法用于肉用动物生产。彻底查禁CL 的非法滥用,必须要有高效、灵敏、特异的残留检测方法。本研究着重应用免疫学和生物化学方法,构建了基于量子点标记的ATP合酶分子马达免疫旋转生物传感器 (immuno-rotary biosensor, IRB),结合荧光技术,利用中国科学院生物物理研究所张仲伦老师研发的BPCL弱光检测器实现了对盐酸克伦特罗快速、高灵敏度的检测。     

纳米银/辣根过氧化物酶自组装免疫传感器测定蜂蜜中的青霉素

利用层层自组装技术,成功将氨基苯磺酸、纳米银和辣根过氧化物酶标记的青霉素抗体固定在玻碳电极表面。实现了聚氨基苯磺酸/纳米银放大型电化学免疫传感器的制备,建立了一种高灵敏度检测青霉素的电化学分析方法。辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化还原3,4-二氨基苯甲酸产生电流信号,进行电化学检测,实现蜂蜜中青霉素的定量测定。同时对测定缓冲液的pH、反应温度和时间等进行了优化,最佳条件下,在0.05~6.00μg/L浓度范围内传感器响应电流和青霉素浓度呈良好线性关系,线性方程为Δi(10-5A)=-0.7265C+4.1522,相关系数为0.9946,检出限为1.02μg/L。同时利用该传感器对蜂蜜样品中的青霉素进行了测定,测定结果与酶联免疫法进行了对比,可知该法测定青霉素灵敏度高,具有良好的选择性和稳定性,适用于检测蜂蜜样品中的青霉素残留。     

基于金磁微粒模拟酶电化学增强体系检测抗坏血酸

通过自组装方法构建金磁微粒(Fe3O4@Au)复合纳米粒子,并表征其理化性能。基于复合纳米粒子的过氧化物模拟酶活性,构建出具有高灵敏度和选择性检测抗坏血酸的无酶增强型电化学传感器。采用循环伏安法对抗坏血酸进行测定,并优化电化学检测体系。结果表明,在最适检测体系下,所构建的无酶电化学传感器对抗坏血酸检测具有较高的灵敏度,抗坏血酸浓度在1~100 mmol/L范围内,电流响应与其具有良好线性关系,工作曲线方程为y=867.81x+3.860 8(R~2=0.991 9),检出限为0.011 7 mg/L。此外,所构建的无酶电化学传感器已成功地应用于实际样品检测。鉴于此,所提出的新型无酶电化学分析方法在食品质量控制和安全检测等领域有着巨大的应用前景。     

基于多壁碳纳米管/海藻酸钠4-SPCE福氏志贺氏菌酶免疫传感器的研究

目的:为增强响应信号,改善生物相容性,研制可以快速检测福氏志贺氏菌(Shigella flexneri,S.flexneri)的电化学免疫传感器。方法:将辣根过氧化物酶标记福氏志贺氏菌抗体(HRP-anti-S.flexneri)吸附在多壁碳纳米管(MWCNT)/海藻酸钠(SA)复合物修饰的四通道丝网印刷电极表面,制得一次性酶免疫传感器。采用原子力显微镜(AFM)表征免疫电极和孵育抗原后的电极表面形态以及循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性;采用一步法检测福氏志贺氏菌,CV监测酶促反应;根据免疫反应前、后还原峰峰电流的降低值来检测样品中的福氏志贺氏菌。结果:在优化的试验条件下,酶免疫传感器与福氏志贺氏菌浓度的对数在104~1011cfu/mL范围保持良好的线性关系,检出限为3.1×103cfu/mL(S/N=3)。结论:该酶免疫传感器放大了电化学反应信号,保持了生物物质的活性,具有较好的特异性、重现性(RSD=7.8%)、稳定性(4℃放置两周后电流响应为初始值的95.16%)和准确性(与GB/T 4789.5-2003符合率为97.5%),有望用于福氏志贺氏菌的快速筛检。     

基于封装酶的金属有机框架纳米酶级联催化实现鱼肉中次黄嘌呤的可视化检测

目的 基于金属有机框架(metal-organic framework, MOF)封装黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)构建纳米酶级联催化体系, 实现次黄嘌呤(Hypoxanthine, Hx)的可视化检测。方法 室温下采用一步法仿生矿化工艺将天然酶XOD封装于1,4-苯二甲酸铜(copper 1,4-benzenedicarboxylate, CuBDC) MOF纳米酶中, 制备封装酶的金属有机框架材料(XOD@CuBDC), 探究其过氧化物酶活性及级联催化性能。通过最适反应条件的优化, 建立颜色强度与Hx浓度的标准曲线, 考察该方法对鱼肉中Hx的检测。结果 与使用游离XOD和CuBDC组成的级联反应系统比较, XOD@CuBDC催化速度更快, 显色强度更强, 酶储存更稳定。该体系的颜色强度与Hx浓度在0.015~0.470 mmol/L范围内具有线性关系(R2>0.99), 方法检出限(S/N=3)为10.47 μmol/L。应用于不同新鲜程度的牙鲆鱼肉中Hx含量测定, 结果与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)呈线性关系, 相关性为0.98865。结论 构建的XOD@CuBDC纳米酶级联催化体系具有良好的稳定性和催化性能, 能够用于鱼肉中Hx的快速检测。     

沙丁胺醇直接竞争ELISA 法快速测定

建立沙丁胺醇的直接竞争ELISA(dcELISA)快速检测方法,采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体,棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数,通过单因素试验,考察反应体系中表面活性剂、离子浓度、甲醇体积分数、pH 值因素对dcELISA 性能的影响,确定最优检测条件,同时考察方法的特异性。结果表明：酶标抗体克分子比为2.1 时偶合物的滴度最高,最佳反应条件为包被抗原质量浓度1μg/mL,酶标抗体稀释2560 倍,0.01mol/L、pH7.4 的磷酸盐抗体稀释液(PBS)中含体积分数0.05% 的Tween-20、0.5mol/L NaCl溶液和体积分数5% 的甲醇时dcELISA 具有最高的灵敏度和最好的稳定性,所建立方法的IC50 为10.3ng/mL,检测限为0.049ng/mL,线性范围0.3～76.30ng/mL,批内变异系数13.8%,批间变异系数为22.38%,与克伦特罗交叉反应率为321.18%,与溴布特罗交差反应率为29.09%,与其他结构类似物没有明显交叉反应。本研究所建立的dcELISA 可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测。     

QuEChERS技术结合高效液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中克伦特罗的残留量

目的 建立一种高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)快速检测动物源性食品中克伦特罗残留量。方法 样品经β-葡萄糖醛甘酶酶解,乙腈提取,经过ProElut QuEChERS净化管净化。采用0.1%甲酸(A)和乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,用多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)对克伦特罗含量进行检测。结果 该方法可以在15 min内完成目标物的分离分析。克伦特罗在0.5、1、5μg/kg添加水平的回收率为90.0%～94.3%,相对标准偏差小于10%(n=6),方法检出限为0.5μg/kg。结论 该方法快速、准确、灵敏,适合用于动物源性食品中克伦特罗的残留量的测定。     

Detection of glucose,galactose, and lactose in milk with a microdialysis-coupled flow injection amperometric sensor

A microdialysis-coupled flow injection amperometric Sensor (microFIAS) was used to determine glucose, galactose, and lactose in milk. The sensor is based on enzyme-catalyzed reaction in combination with the three well-established analytical techniques, namely; microdialysis sampling, flow injection analysis (FIA), and amperometric detection. With the multianalyte sensor it was possible to detect glucose and galactose by sequential injection of their corresponding oxidase enzymes: glucose oxidase and galactose oxidase, while lactose was determined by injection of a mixture of beta-galactosidase and glucose oxidase enzymes. The sensor showed a linear response between 0.05 and 10 mM for glucose, between 0.1 and 20 mM for galactose and between 0.2 and 20 mM for lactose, respectively. The relative standard deviation values of the sensor measurements for glucose, galactose, and lactose were 3-4% (n = 3). The sensor measurements for lactose content in milk were compared with a standard method with an infrared spectrophotometer.     

基于纳米酶技术检测柑桔果实中葡萄糖

目的建立纳米酶检测体系快速检测葡萄糖含量的技术。方法采用甲烷氧化细菌的发酵代谢产物甲烷氧化菌素(methanobactin,MB)与Cu²⁺、纳米金(AuNPs)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,Gox)进行配位结合形成具有过氧化物酶和葡萄糖氧化酶性质的纳米酶检测体系,并对柑桔果实中葡萄糖含量进行测定。结果Gox浓度0.81 U/mL、MB-Cu@AuNPs模拟酶浓度2×10^-5mol/L、对苯二酚浓度5×10^-4mol/L、反应温度60℃、pH 8为最佳检测条件;反应时间5 min,葡萄糖浓度线性范围为1×10^-3-5×10^-2mol/L。结论纳米酶检测体系对柑桔果实中葡萄糖含量的测定具有良好的稳定性,相比较常规快速血糖仪检测速度更快。     

Photoelectrochemical sensor for the rapid detection of in situ DNA damage induced by enzyme-catalyzed fenton reaction

Photoelectrochemical sensors were developed for the rapid detection of oxidative DNA damage induced by Fe2+ and H2O2 generated in situ by the enzyme glucose oxidase. The sensor is a multilayer film prepared on a tin oxide nanoparticle electrode by layer-by-layer self-assembly and is composed of separate layers of a photoelectrochemical indicator, DNA, and glucose oxidase. The enzyme catalyzes the formation of H2O2 in the presence of glucose, which then reacts with Fe2+ and generates hydroxyl radicals by the Fenton reaction. The radicals attack DNA in the sensor film, mimicking metal toxicity pathways in vivo. The DNA damage is detected by monitoring the change of photocurrent of the indicator. In one sensor configuration, a DNA intercalator, Ru(bpy)2(dppz)2+ (bpy = 2,2'-bipyridine, dppz = dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine), was employed as the photoelectrochemical indicator. The damaged DNA on the sensor bound less Ru(bpy)2(dppz)2+ than the intact DNA, resulting in a drop in photocurrent. In another configuration, ruthenium tris(bipyridine) was used as the indicator and was immobilized on the electrode underneath the DNA layer. After oxidative damage, the DNA bases became more accessible to photoelectrochemical oxidation than the intact DNA, producing a rise in photocurrent. Both sensors displayed substantial photocurrent change after incubation in Fe2+/glucose in a time-dependent manner. And the detection limit of the first sensor was less than 50 microM. The results were verified independently by fluorescence and gel electrophoresis experiments. When fully integrated with cell-mimicking components, the photoelectrochemical DNA sensor has the potential to become a rapid, high-throughput, and inexpensive screening tool for chemical genotoxicity.     

固定化酶化学发光型葡萄糖传感器法测定食品中的葡萄糖

制成了固定化酶化学发光型葡萄糖传感器,此传感器可用于对葡萄糖的在线快速检测。用MCM-41介孔分子筛固定葡萄糖氧化酶(GOD),制成GOD酶柱,并用于流动注射化学发光分析。酶柱的使用条件为:柱温40℃,葡萄糖溶液pH=6.0,流速3 r/min。测定的线性范围为1～200 mg/L,检出限为0.2 mg/L,10次测定的RSD为1.8%,回收率在97.81%～102.0%。测定结果与国标方法的测定结果无显著性差异。     

聚硫堇修饰的一次性葡萄糖生物传感器的研制

研制了一种用于食品中葡萄糖快速检测的一次性电化学酶传感器。通过循环伏安法将电子媒介体硫堇电聚合在丝网印刷碳(SPCE)电极上,然后用壳聚糖二氧化硅溶胶凝胶包埋葡萄糖氧化酶,涂布于已修饰硫堇的丝网印刷碳电极表面,制成了新型葡萄糖生物传感器。实验表明该传感器响应快、灵敏度高、稳定性好,在对葡萄糖测定中表现出良好的响应特性,并具有抗柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸钠、蔗糖、果糖等干扰的特点。在葡萄糖浓度为5.2×10-5～2.5×10-3mol/L,酶电极的响应电流的变化值与葡萄糖的浓度呈良好的线性关系,线性方程为Y=0.049 01+2.729 32x,最低检出限为4.96×10-6mol/L。     

钴酞菁与碳纳米管共修饰碳纤维织物传感器的制备及其电化学性能

为探索钴酞菁(CoPc)/碳纳米管(CNT)柔性葡萄糖传感器在葡萄糖检测中的应用,制备了一种CoPc和CNT共修饰的柔性碳纤维织物(CFT)修饰电极,并利用电化学工作站的银/氯化银参比电极和铂对电极与其共同组成三电极体系的葡萄糖传感器。借助扫描电子显微镜对修饰电极进行表征,采用循环伏安法、电化学阻抗图谱法、时间-电流曲线法研究葡萄糖传感器的电化学性能。结果表明:该修饰电极具有良好的导电性和电子转移能力,葡萄糖检测线性范围为4×10^-3~2.6 mmol/L,检测限为1.4 μmol/L (信噪比为3),灵敏度为231 μA·L/mmol;该修饰电极在检测葡萄糖时具有较好的重复性,测试10次后其响应电流仍可达到初始值的94.6%,且对果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、抗坏血酸、多巴胺、尿酸等物质具有较强的抗干扰性能。     

海洋高产低温葡萄糖氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

从黄海和渤海海泥样品中筛选高产低温葡萄糖氧化酶（GOD）菌株并进行鉴定,对其所产GOD的蛋白分子质量和酶学性质进行初步研究。获得一株高产葡萄糖氧化酶菌株（编号G01）,根据菌株形态特征及ITS序列分析,初步鉴定该菌株为壳青霉（Penicillium crustosum）。结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶谱分析,得出菌株G01所产葡萄糖氧化酶分子质量约为95 ku,初步判断为五聚体,为一种新酶。酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为25 ℃,在0 ℃时仍保留有50%以上的酶活,热稳定性差,为典型低温酶;最适反应pH值为4.5,对pH敏感;Mn2+能促进酶活,K+、Na+对酶活基本无影响;而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特别是Fe3+对酶活有明显抑制作用。酶学性质表明该酶作为一种新酶,在低温和水产饲料领域有良好应用前景。     

复合生物酶制备抗菌纸的研究

将葡萄糖氧化酶和溶菌酶单独及复配使用,并以表面涂布的方式将其涂布到到纸张表面,使其在纸张表面发挥最佳抗菌效果,从而得到绿色抗菌纸;通过SEM、TEM及抑菌环实验表征抗菌纸的抗菌效果。结果表明,葡萄糖氧化酶单独使用,在p H值为6.5时,较佳酶用量范围为4000~6000 U/g绝干浆;溶菌酶单独使用,在p H值为5.5时,较佳酶用量为5000~20000 U/g绝干浆。当溶菌酶和葡萄糖氧化酶复配时,葡萄糖氧化酶用量为4000 U/g绝干浆,溶菌酶用量为10000 U/g绝干浆,p H值为6.0时,抗菌纸抑菌效果最好。通过SEM、TEM和抑菌环分析均表明,两种酶复配使用比两种酶分别单独使用时,抗菌纸抑菌效果更明显。     

微胶囊化葡萄糖氧化酶对面粉烘焙品质的改良研究

为改善葡萄糖氧化酶对面粉的改良效果,文中通过与游离葡萄糖氧化酶做对比,研究了海藻酸钠—壳聚糖包埋后的微胶囊化葡萄糖氧化酶(CACH-GOD)对面粉粉质特性、拉伸特性和焙烤品质的影响。结果显示:微胶囊化葡萄糖氧化酶的对面团的作用速度更为合理,对面粉的粉质、拉伸特性有明显的改善效果。添加微胶囊化葡萄糖氧化酶的面包品质好,面包的比容、高径比和质构评价指标都优于游离的葡萄糖氧化酶。     

双酶水解法制备鹿胎盘活性多肽

采用双酶水解的方法制备鹿胎盘生物活性肽。以水解度和酸溶性肽得率为指标,确定了木瓜蛋白酶与胰蛋白酶为最优酶系组合。通过正交实验得出酶解工艺条件为:pH 7.0、温度52℃、酶活添加量6 000u/g(料)、底物浓度10%、酶比为1∶1,水解时间3 h,在此条件下对鹿胎盘进行水解,水解度为34.5%,酸溶性多肽得率为81.56%。