单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因转染骨髓基质干细胞治疗大鼠脑胶质瘤

目的研究转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法原代培养BMSCs,AdCMV-tk转染BMSCs。逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测BMSCs/tk对tk基因的转录。以BrdU标记BMSCs/tk,观察其趋瘤性。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对C6细胞的旁观者效应。将BMSCs/tk注入脑胶质瘤大鼠肿瘤对侧脑组织,原位末端标记(TUNEL)法检测脑内肿瘤细胞凋亡,动态MRI监测肿瘤体积的变化,观察荷瘤鼠生存期。结果全骨髓细胞培养法可获得纯化的BMSCs。感染AdCMV-tk 21 d后,BMSCs仍有明显的tk基因表达。转染tk基因后的BMSCs仍具有明显的趋瘤性。BMSCs/tk不仅在体外可产生明显的旁观者效应,在荷瘤鼠脑内也显示了明显的诱导肿瘤细胞凋亡的旁观者效应,凋亡阳性率为20.38%±2.57%,与BMSCs组(2.56%±0.52%)和对照组(2.74%±0.38%)相比,差异均有统计学意义(P值分别为0.023和0.025)。BMSCs/tk移植3周时,BMSCs/tk组、BMSCs组和对照组肿瘤体积分别为(8.28±2.64)、(134.51±16.37)和(147.22±31.05)mm3,BMSCs/tk组远小于BMSCs组(P=0.001)和对照组(P<0.01),并且部分大鼠脑内肿瘤消失。BMSCs/tk组大鼠生存期为(52.60±13.11)d,与对照组相比明显延长(P=0.01)。结论HSV-tk转染的BMSCs可能成为脑胶质瘤治疗的有效手段。     

静脉注射骨髓基质干细胞对放射性脑损伤模型大鼠认知障碍的影响

目的观察静脉注射骨髓基质干细胞(MSCs)对放射性脑损伤模型大鼠认知功能的影响。方法离体分离、培养、增殖成年大鼠MSCs。采用6 MV X线对8～10周龄雌性SD大鼠做全脑照射,照射剂量20 Gy。照后1周采用尾静脉注射Hoechst33342荧光标记的MSCs(4×10~6),注射后4、8周观察大鼠认知功能变化,应用免疫荧光技术检测大鼠脑内Hoechst33342标记细胞及分化的功能细胞。结果与正常对照组相比,模型组大鼠的学习记忆能力明显受损(P<0.01),静脉注射后4、8周,照射组大鼠认知功能明显改善(P<0.05)。结论静脉注射MSCs可显著改善全脑照射大鼠认知功能,MSCs可在放射性脑损伤大鼠脑组织中存活和分化。     

骨髓间充质干细胞表达外源性IL-12对胶质瘤C6细胞增殖的影响

目的: 探讨以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 为基因治疗载体表达外源性IL-12对胶质瘤C6细胞增殖的影响.方法:分离培养大鼠MSCs, 腺病毒介导IL-12基因转染大鼠MSCs(AdIL-12-MSCs),RT-PCR 及Western Blotting检测AdIL-12-MSCs中IL-12基因mRNA及蛋白表达.MTT法检测AdIL-12-MSCs分泌的外源性IL-12对C6胶质瘤细胞增殖活性的影响,光镜下观察外源性IL-12对C6细胞形态的影响.结果:腺病毒介导IL-12基因成功转染MSCs形成AdIL-12-MSC,其IL-12基因在mRNA及蛋白水平均有明显表达.AdIL-12-MSC分泌的外源性IL-12显著抑制胶质瘤C6细胞的增殖(P<0.05).结论:转染IL-12的MSCs(AdIL-12-MSC)能够在mRNA及蛋白水平表达外源性IL-12基因,显著抑制胶质瘤C6细胞的增殖.     

基质金属蛋白酶对胶质瘤干细胞侵袭作用的影响

目的:分别在体内及体外条件下,观察恶性胶质瘤肿瘤干细胞(CancerStemCells,CSCs)的侵袭能力,检测恶性胶质瘤不同细胞亚群的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和-9(MMP-9)的表达,探讨其与CSCs侵袭能力的相关性.方法:应用神经干细胞(neural stem cells,NSCs)培养基体外分离培养原代恶性胶质瘤细胞,应用自我更新分析、免疫细胞化学染色、体内成瘤分析等技术鉴定CSCs细胞亚群.分别在体内、体外条件下,应用细胞侵袭分析技术观察不同肿瘤细胞亚群的侵袭能力,应用实时RT-PCR、Western blot、免疫组织化学染色方法,检测不同肿瘤细胞亚群中MMP-2、MMP-9的表达情况.结果:原代培养的恶性胶质瘤细胞被分离鉴定为CSCs和非肿瘤干细胞(non-CSCs).胶质瘤CSCs的促侵袭能力明显强于non-CSCs;MMP一2的表达水平在两个细胞亚群间存在显著差异(P<0.000 1).且均明显高于MMP-9表达;在胶质瘤CSCs接种的动物脑组织中,MMP-2与MMP-9的表达均呈时间依赖性增高,MMP-9则仅在肿瘤组织中表达,其表达增长率高于MMP-2,且主要定位于肿瘤的边缘.结论:在不同的条件下,胶质瘤CSCs可能是通过MMP-2或MMP-9促进了肿瘤细胞的侵袭及肿瘤的侵袭性生长.特异性抑制胶质瘤CSCs明胶酶分泌,尤其是MMP-9,将为抗肿瘤治疗提供有效的手段.未来针对于CSCs与其它MMPs家族成员及其抑制剂的研究将有利于进一步阐述胶质瘤的侵袭机制,同时也将为抗恶性胶质瘤的治疗提供新的策略.     

转染IL－18基因的大鼠胶质瘤细胞疫苗9L／IL－18对胶质瘤大鼠中TGF－β和Fgf2水平的影响

目的：观察转染 IL －18基因的大鼠胶质瘤细胞疫苗9L／IL －18对胶质瘤大鼠血清 TGF －β和肿瘤组织中 Fgf2水平的影响。方法：将 F344大鼠随机分为3组,分别接种9L／IL －18、9L／LXSN 和9L 细胞。ELISA 法检测大鼠血清中 TGF －β水平,RT －PCR 方法检测肿瘤组织中 Fgf2 mRNA 的表达。结果：接种9L／IL －18细胞大鼠的外周血中 TGF －β的水平低于其他两组,差异有统计学意义（P ＜0．05）,肿瘤组织中Fgf2 mRNA 的表达均低于其他两组（P ＜0．05）。结论：IL －18通过降低 TGF －β和Fgf2的水平,起到抗肿瘤的作用。     

IL-18的研究进展

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)首先作为INF-γ诱导因子,由于其在炎症和免疫应答中的重要作用而被发现[1]。IL-18是1995年Okamura等在脂多糖诱导的小鼠中毒性休克的肝脏中提取出[1],结构及胞内信号转导通路类似于IL-1家族,而功能类似于IL-12家族的1种蛋白分子。但是与IL-12相比,IL-18有更强的诱导生成INF-γ的能力。     

骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤定向迁移及其DAPI标记的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BSMCs)向C6胶质瘤定向迁移的能力以及DAPI用于BMSCs向胶质瘤体内迁移示踪的价值。方法:直接贴壁法分离培养纯化BMSCs。利用Transwell小室建立体外迁移模型检测BMSCs向C6胶质瘤细胞定向迁移的能力。立体定向法建立大鼠C6胶质瘤模型,利用DAPI体外标记培养、纯化的BMSCs,经荷瘤侧颈内动脉灌注,观察BMSCs向C6胶质瘤组织的定向迁移能力,并评价这一过程中DAPI用于BMSCs标记的价值。结果:通过直接贴壁法分离、培养、传代,获得了纯化的BMSCs。体外迁移实验证实,BMSCs具有向C6胶质瘤细胞定向迁移的能力,迁移细胞数量为400倍视野下(32.1±10.5)/HP。DAPI标记后BMSCs细胞核呈蓝色荧光,阳性率达100%。经荷瘤大鼠颈内动脉灌注后BMSCs可以存活,并表现出向脑胶质瘤趋化迁移的特性,分布区域主要位于肿瘤内部血管周边。结论:DAPI可以用于BMSCs的体内示踪,BMSCs具有通过血肿瘤屏障向C6胶质瘤定向迁移的能力,经颈内动脉灌注是其有效的移植途径。     

骨髓间充质干细胞表达外源性IL-12对胶质瘤C6细胞增殖的影响

目的:探讨以骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs） 为基因治疗载体表达外源性IL12对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法：分离培养大鼠MSCs, 腺病毒介导IL12基因转染大鼠MSCs(AdIL12MSCs),RTPCR 及Western Blotting检测AdIL12MSCs中IL12基因mRNA及蛋白表达。MTT法检测AdIL12MSCs分泌的外源性IL12对C6胶质瘤细胞增殖活性 的影响,光镜下观察外源性IL12对C6细胞形态的影响。结果：腺病毒介导IL12基因成功转染MSCs形成AdIL12MSC,其IL12基因在mRNA及蛋白水平均有明显表达。AdIL12MSC分泌的外源性IL12显著抑制胶质瘤C6细胞的增殖（P<0.05）。结论：转染IL12的MSCs(AdIL12MSC)能够在mRNA及蛋白水平表达外源性IL12基因,显著抑制胶质瘤C6细胞的增殖。     

IL-18对胶质瘤大鼠外周血TGF-β、CD8+T水平的影响

目的:分析IL-18对胶质瘤大鼠外周血中TGF-β水平及CD8+T比例的影响.方法:将大鼠随机分为3组,每组5只.分别用立体定向技术接种9L/IL-18、9L、9L/LXSN细胞,建立实验动物模型.14天后,取各组大鼠外周血,ELISA法检测各组大鼠外周血中TGF-β细胞水平.流式细胞术检测各组大鼠外周血中CD8+T比例.结果:接种9L/IL-18组大鼠外周血中TGF-β的水平为(111.5±5.9) ng/L,显著低于接种9L、9L/LXSN细胞组[(133.4±3.7) ng/L、(127.9±4.0)ng/L] (P＜0.05).前者外周血中CD8+T比例(32.3±2.2)％与后两组相比[(分别为(22.3±0.8)％、(22.0±0.7)％]显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:IL-18可降低荷瘤鼠外周血中TGF-p水平,提高CD8+T细胞比例,从而改善荷瘤鼠免疫抑制状态,提高免疫功能.     

永生化人骨髓基质干细胞系MSCxj的转化特征

目的明确永生化人骨髓基质干细胞系MSCxj是否具有转化特征。方法复苏已建立的永生化人骨髓基质干细胞系MSCxj，扩大培养，从致瘤性、血清依赖性、悬浮生长能力和接触抑制性等方面观察细胞的转化特征。结果细胞无裸鼠致瘤性，在软琼脂内不能生长，血清依赖性无显著降低，仍具有接触抑制性。结论MSCxj基本上为正常细胞而无明显转化特征。     

骨髓基质干细胞趋瘤性及神经分化潜能

目的:观察骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)向脑胶质瘤的趋向性及在荷瘤大鼠脑内的分化,初步探讨其机制。方法:培养BMSCs后,在体外应用显微镜直接观察及Transwell试验检测BMSCs向胶质瘤细胞及血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等的迁移特性,免疫荧光方法检测其在颅内向脑胶质瘤迁移的情况。在体外诱导条件下,观察BMSCs的分化;BMSCs移植到脑荷瘤大鼠脑内15 d后,免疫荧光方法检测其在体内的分化。结果:骨髓基质干细胞在体外表现出明显的向胶质瘤细胞及PDGF、EGF的迁移特性,在体内表现了明显的向脑内胶质瘤迁移的特性,并可迁移到肿瘤卫星灶周围。在体外诱导条件下BMSCs可分化为神经前体细胞(8.4%±3.5%)、神经元(53.7%±7.4%)及胶质细胞(22.3%±5.2%);在移植到荷瘤鼠脑内后,也可分化为神经前体细胞(8.3%±3.6%)、神经元(15.7%±4.3%)及胶质细胞(32.5%±7.2%),两者向神经元分化的比例存在差异(P<0.05),向神经前体细胞及胶质细胞的分化比例相似(P>0.05)。结论:骨髓基质干细胞有明显的胶质瘤趋瘤性,其向神经细胞分化的方向可能与其局部微环境有关。     

Exosomes from marrow stromal cells expressing miR-146b inhibit glioma growth

Exosomes are 30–150 nm vesicles secreted by a wide range of mammalian cells that can contain microRNA (miRNA). To test if marrow stromal cell (MSC) exosomes could be used as a vehicle for delivery of anti-tumor miRNAs, we transfected MSCs with a miR-146b expression plasmid, and harvested exosomes released by the MSCs. Intra-tumor injection of exosomes derived from miR-146-expressing MSCs significantly reduced glioma xenograft growth in a rat model of primary brain tumor.     

ADAM17-shRNA转染的骨髓间充质干细胞对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响

目的:探讨转染解聚素-金属蛋白酶17-shRNA(a disintegrin and metalloprotease 17-shRNA,ADAM 17-shRNA)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,BMMSC)对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的抑制效果.方法:全骨髓贴壁法分离并培养3周雄性SD大鼠的BMMSC,利用慢病毒介导的ADAM17-shRNA转染BMMSC.30只裸鼠建立MCF-7乳腺癌移植瘤模型,种植肿瘤细胞14d后建模成功.按照数字表法随机分成对照组(注射等量PBS)、BMMSC组(注射l×106/mlBMMSC)和转染组(注射1×106/ml转染ADAM 17-shRNA的BMMSC),每组10只.在种植细胞第15天开始经尾静脉注射BMMSC进行抑瘤实验(0.1 ml/只,每3d给药1次,共计5次),观察裸小鼠移植瘤的生长情况;抑瘤实验16d后处死裸鼠.利用Real-time PCR法检测移植瘤组织ADAM17 mRNA表达,Westem blotting法检测移植瘤组织ADAM 17蛋白表达.结果:抑瘤实验16d时,对照组、BMMSC组移植瘤体积明显高于转染组[(787.15±25.95)、(767.02±28.98) vs (361.89±19.75)mm3,均P＜0.01];BMMSC组、转染组抑瘤率明显高于对照组(2.57％、53.89％ vs 0.00％,均P＜0.05).对照组、BMMSC组ADAM17 mRNA的表达水平明显高于转染组(1.00±0.01、0.97±0.08 vs 0.30±0.09,均P＜0.05);对照组、BMMSC组ADAM 17蛋白表达水平明显高于转染组(0.70±0.09、0.68±0.02 vs 0.45±0.05,均P＜0.05).结论:ADAM 17-shRNA通过BMMSC介导可将ADAM17靶向归巢至裸鼠乳腺癌移植瘤并发挥抑瘤作用.     

甲异靛对白血病骨髓基质细胞调节白血病细胞增殖的影响

 【摘要】　目的　探讨甲异靛对白血病骨髓基质细胞干预白血病细胞增殖的影响。方法 　利用白血病骨髓单个核细胞培养骨髓基质细胞,并建立白血病细胞和骨髓基质的共培养体系。用锥虫蓝拒染实验测定甲异靛对共培养体系中白血病细胞增殖的影响;流式细胞术检测白血病细胞膜上CXCR4的表达。结果　白血病骨髓基质细胞可抑制白血病细胞的增殖。低浓度的甲异靛（5 μmol／L）可促进白血病和骨髓基质细胞共培养体系中白血病细胞的增殖。白血病细胞膜异常高表达CXCR4,甲异靛可明显抑制HL-60细胞和原代白血病细胞膜上CXCR4的表达,骨髓基质细胞可以促进白血病细胞膜上CXCR4的表达。结论　甲异靛可能通过下调白血病细胞膜上CXCR4的表达起抗白血病作用。     

Hierarchical regulation of interleukin production: Induction of interleukin 6 (IL-6) production from bone marrow cells and marrow stromal cells by interleukin 3 (IL-3)

IL-3 stimulated the production of IL-6 from a bone marrow-adherent cell population, macrophages and from hemopoietic supportive stromal cell lines. It also induced IL-6 production from a stem cell-enriched population of bone marrow cells which did not produce IL-6 without stimulation. In contrast, stimulation with IL-6 of all the cell populations studied in the present experiments did not induce IL-3 production. These results indicate a hierarchical network in the regulation of interleukin production, and existence of a positive feedback mechanism; IL-3 induces IL-6 production which in turn stimulates stem cells into cycle and induces stem cells to respond to IL-3.     

骨保护素/骨保护素配体（OPG/OPGL）在骨髓基质干细胞复合同种骨修复骨缺损中的表达及意义

目的 探讨OPG/OPGL蛋白在骨髓基质干细胞（BMSCs）复合同种骨移植修复大鼠桡骨缺损中的表达及意义.方法 4周龄SD大鼠BMSCs体外分离培养,取生长状态良好的第3代细胞复合同种骨.同时取8周龄SD大鼠32只,雌雄不限,制备大鼠双侧桡骨中段5mm节段性骨缺损模型.采用自身对照的方法 ,一侧植入BMSCs及同种异体骨颗粒复合物作为实验组;另一侧植入等量单纯同种异体骨颗粒作为对照组.按术后2、4、8、12周4个时间点（每个时间点8只）处死动物并立即于骨缺损部位取材,大体及组织学观察、免疫组织化学（PV法）检测OPG、OPGL蛋白的表达.免疫组化所得数据经计算机图像分析系统计算其平均光密度值（OD值）.结果 术后各时间点大体形态与组织学观察：实验组骨缺损修复速度均明显优于对照组;OPG蛋白免疫组化结果 显示：2、4、8周实验组OPG的表达高于对照组（P＜0.05）,而12周时两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;OPGL蛋白免疫组化结果 显示：2、4周实验组OPGL的表达高于对照组（P＜0.05）,而8、12周时两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 骨缺损修复区OPG、OPGL蛋白表达水平与骨修复愈合程度密切相关.OPG蛋白表达升高,其成骨作用加强, 而OPGL蛋白表达则相反.提示OPG的高表达可促进骨愈合,减少骨吸收;反之则促进骨吸收.     

In vitro growth of hematopoietic progenitors and stromal bone marrow cells from patients with multiple myeloma

In the present study we have determined the content of hematopoietic and stromal progenitors in multiple myeloma (MM) bone marrow, and assessed their in vitro growth. Marrow cells were obtained from 17 MM patients at the time of diagnosis, and from 6 hematologically normal subjects. When mononuclear cells (MNC) from MM marrow were cultured, reduced numbers of hematopoietic progenitors were detected and their growth in long-term cultures was deficient, as compared to cultures of normal cells. When cell fractions enriched for CD34⁺ Lin⁻ cells were obtained, the levels of hematopoietic progenitors from MM marrow were within the normal range, and so was their growth kinetics in liquid suspension cultures. The levels of fibroblast progenitors in MM were not statistically different from those in normal marrow; however, their proliferation potential was significantly reduced. Conditioned media from MM-derived MNC and stroma cells contained factors that inhibited normal progenitor cell growth. Our observations suggest that hematopoietic progenitors in MM marrow are intrinsically normal; however, their growth in LTMC may be hampered by the presence of abnormal accessory and stroma cells. These results suggest that besides its role in the generation of osteolytic lesions and the expansion of the myeloma clone, the marrow microenvironment in MM may have a negative effect on hematopoiesis.     

In vivo growth of C6 glioma cells transfected with connexin43 cDNA.

In order to examine the possible role of intercellular communication via gap junctions in the control of tumor growth, we have transfected C6 glioma cells with connexin43 cDNA. We obtained several clones with variable expression of connexin43. The growth rate of these clones in culture was inversely related to the degree of expression of the transfected cDNA. To examine the growth of these transfected cells in vivo, cells were grown in spinner culture flasks to form spheroids 250-300 microns in diameter. Spheroids of nontransfected C6 cells produced large gliomas. Immunohistochemical and in situ hybridization analyses revealed relatively high levels of connexin43 protein and mRNA in the host tissue, while little of this protein was detected in the glioma. In contrast, spheroids of connexin43-transfected cells grew more slowly and exhibited elevated levels of connexin43 protein and mRNA. These findings suggest that the expression of connexin43 may be associated with the control of brain tumor growth in vivo.